2012 Fiscal Year Research-status Report
小胞体ストレスセンサータンパク質の時空間的イメージングによるストレス応答の解析
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23510283
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
田代 悦 慶應義塾大学, 理工学部, 講師 (00365446)
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| Keywords | IRE1α / BiFC / 小胞体ストレス / イメージング |
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| Research Abstract |
UPR(Unfolded Protein Response)は小胞体内の恒常性維持機構である。UPRは3つの小胞体ストレスセンサーの活性化を介して制御されているが、近年、これらセンサーの活性化の強度や速度がさまざまな生理的・薬理的条件で異なることが示唆されている。よって、これら差異を解析することはUPR機構のさらなる理解に繋がると期待される。我々は、3つのセンサーの活性化を3色の蛍光でイメージングする系の構築に取り組んでいる。本年度は、IRE1αの活性化に必要十分なステップ二量体化を分断された蛍光蛋白質の再構成によりタンパク質間相互作用を検出するBiFC法を用いて検出する系の構築を行った。
IRE1αのC末端欠損体に青色蛍光タンパク質ceruleanのN末端もしくはC末端断片を結合させた融合タンパク質を設計し、その両方を安定発現する細胞を作製した。通常培養条件下では青色蛍光はほとんど観察されなかったが、小胞体ストレス誘導剤DTTを処理すると青色蛍光が観察された。また小胞体に局在しているIRE1αは二量体化するとドット状の局在に変化するとの報告と同様に、DTT添加による青色蛍光の局在もドット状であった。さらに他の小胞体ストレス誘導剤 (tunicamycin、thapsigargin)の添加によっても青色蛍光が観察され、さらにその蛍光はドット状の局在だった。これらより、青色蛍光は融合タンパク質の二量体化を反映していると示唆された。また、青色蛍光を経時的に観察したところ、DTT やthapsigarginは添加1時間後から、tunicamycinは4時間後から顕著に観察され、これらの時系列変化は内在性IRE1α活性化の時系列変化と概ね一致した。以上、本検出系は内在性IRE1αの活性を反映しており、また様々な化合物が誘導するIRE1α活性化速度の差異解析にも有用であると示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
UPRは小胞体内に不良タンパク質が蓄積した時に活性化する小胞体内の恒常性維持機構である。UPRは小胞体膜上に局在する3つの小胞体ストレスセンサー (ATF6, IRE1α, PERK)の活性化を介して制御されているが、近年、これら小胞体ストレスセンサーの活性化の強度や速度が、さまざまな生理的・薬理的条件で異なることが示唆されている。したがって、これらの差異を解析することはUPR制御機構のさらなる理解に繋がると期待される。そこで本研究の目的は、3つのセンサータンパク質の活性化を3色の蛍光でイメージングする系の構築である。これまでにATF6のイメージング及び本年度はIRE1αの活性をイメージングする系の構築に成功した。したがって、残り１年でATF6の活性化をイメージングする系の構築に取り組む。したがって、概ね順調に研究は達成できていると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
PERKの活性化をBiFC法によってイメージングする系を構築する。PERKはN末端が二量体化すると活性化することが知られているため、PERKのN末端にmCherryのN末端もしくはC末端断片を融合させ、そのコンストラクトを安定的に発現する細胞系を取得する。そして様々な小胞体ストレス誘導剤を添加した時のセンサーの活性化パターンを測定する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
PERKの活性化をBiFC法によってイメージングするためのコンストラクトを作るため、遺伝子クローニングや遺伝子改変をする必要がある。そのための酵素代やシーケンス代として研究費を使用する。また出来たコンストラクトを安定的に発現する細胞の構築およびその維持のために、細胞培養シャーレなどの購入に研究費を使用する。
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