2011 Fiscal Year Research-status Report
紡錘体チェックポイント終了に働くＳＩＲＴ２分子がオートファジーを抑制する意義
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23570005
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| Research Institution | Tottori University |
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Principal Investigator |
井上 敏昭 鳥取大学, 医学部, 准教授 (80305573)
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| Project Period (FY) |
2011-04-28 – 2014-03-31
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| Keywords | 紡錘体チェックポイント / SIRT2 / 中心体 |
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| Research Abstract |
紡錘体チェックポイント（SAC）を誘導した場合(SAC-On)、SIRT2ノックダウン細胞でオートファジーが亢進していることは、GFP融合LC3（オートファゴソームのマーカー）のドット形成の観察による。この点をより確かなものとするために、生化学的にLC3、p62を評価系のイムノブロットで追認した。今後オートファジーレベルの定量的評価にはこれらを併用することとした。電顕観察でのオートファゴソーム形成の亢進での確認を進めている.H23年度では、SIRT2によるオートファジー抑制がSAC-Offへの移行に必要なことをオートファジー実行に必要な分子のノックダウンにより明確に示すことができた。またSIRT2によるオートファジー抑制にはHDAC6が関与し、HDAC6はSIRT2と同じ経路上でオートファジーのレベルの制御を行なっていることを明らかにした。このようにSIRT2によるSACからの細胞死誘導にはオートファジーの抑制が関与していること、そしてここに関わる分子としてHDAC6を提示するに至った。HSP70.2はHDAC6と同様にSIRT2と結合する蛋白として同定し、HDAC6と同様にSIRT2と同じ経路で働くことを予想していたが、HSP70.2に対する複数のsiRNAを用いて検討したところ、HSP70.2をノックダウンできるにも関わらず、SIRT2 siRNAによるオートファジー亢進を抑制できないものがあり、単にsiRNAのサイドエフェクトの可能性が排除できない。HSP70.2についての解析はペンディングにしている上記の解析においては、SIRT2ノックダウン時に見られるSAC時の中心体の断片化についても解析した。その結果SAC-Onからの細胞死誘導と中心体の断片化もレベルの相関することも確認でき、オートファジーとSACからの細胞死誘導、中心体の断片化がよく関連することが分かった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
SIRT2とオートファジーとの関連が明確に示され、SAC-Onからの細胞死誘導にこのプロセスが必須であることが明らかになった。強いエビデンスが得られたという点で順調といえる。また次年度の計画として予定していた中心体断片化とSAC-Onからの細胞死誘導との関係については、予定よりも早くそのエビデンスが得られたことからも順調といえる。
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| Strategy for Future Research Activity |
SAC-On細胞でのオートファジー抑制が中心体保全に重要かどうかを明らかにするSIRT2ノックダウン細胞がSAC-Onに突入した際に見られる中心体崩壊について、断片化した中心体はオートファゴソームに囲まれているのかどうかについて、中心体（γ-tubulin）と内在LC3-IIの免疫染色を行い、両者の共局在の有無から判断する。SIRT2ノックダウン細胞に対し、さらにATG5, LC3, HDAC6, Hsp70sをノックダウンすることでSAC-Off能は回復する。このときオートファジーレベルは正常レベルにまで戻っていること、中心体構造・数は正常であることが予想され、このことを免染にて確認する。そしてこれらの細胞では、中心体がオートファゴソームと局在を異にし、分解から逃れていることを示す。中心体崩壊はSAC-Offを阻害するか上述の計画で、SIRT2によるオートファジー抑制が、中心体機能確保とSAC-Offに必要なことが明らかになる。それでは、後者二つの関係はどうなのだろう。つまり中心体からSAC-Off移行への何らかのシグナルは発せられているのだろうか。この点を明らかにするためSIRT2ノックダウン以外の方法でSAC-On細胞に中心体崩壊を誘導し、その際のSAC-Offへの移行の有無を検出する。まずはSACと関係なく中心体崩壊を誘導できる方法（Lats2, Rad51B, Aki, Kiz等のノックダウン）を試み、SAC-Onの状態で中心体崩壊を呈するケースがどれであるのか知りその細胞のSAC-Off能を解析する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
今後の研究の推進方策に示したことを行うためには消耗品、特に細胞培養関連試薬、核酸・蛋白解析試薬の購入が中心となる。また日本癌学会（札幌）参加のやめの旅費も私用計画に組み入れている。次年度使用額22,158円が生じたが、これは細胞培養関連試薬経費がの予定よりも低く抑えられたため発生したが、次年度の細胞培養関連試薬経費として使用したい。
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[Journal Article] MicroRNA-143 Regulates Human Osteosarcoma Metastasis by Regulating Matrix Metalloprotease-13 Expression.2011
Author(s)
49.Osaki M, Takeshita F, Sugimoto Y, Kosaka N, Yamamoto Y, Yoshioka Y, Kobayashi E, Yamada T, Kawai A, Inoue T, Ito H, Oshimura M, Ochiya T.
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Journal Title
Mol. Ther.
Volume: 19
Pages: 1123-1130
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Identification of PITX1 as a TERT suppressor gene located on human chromosome 5.2011
Author(s)
48.Qi DL, Ohhira T, Fujisaki C, Inoue T, Ohta T, Osaki M, Ohshiro E, Seko T, Aoki S, Oshimura M, Kugoh H
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Journal Title
Mol. Cell. Biol.
Volume: 31
Pages: 1624-1636
DOI
Peer Reviewed
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