2011 Fiscal Year Research-status Report
核酸－タンパク質複合体構造を基盤としたＬＩＮＥの転移プロセスの解明
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23570139
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
真板 宣夫 徳島大学, 疾患酵素学研究センター, 准教授 (00404046)
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| Project Period (FY) |
2011-04-28 – 2014-03-31
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| Keywords | レトロトランスポゾン / 結晶構造解析 |
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| Research Abstract |
２３年度はLINE-ORF2pの前半部分であるEN-Mybドメインに焦点を当て、構造解析まで行う計画であった。由来が異なると構造解析が容易になる場合があるため、これまでよりも多様なLINEを用いて行うことにした。前年度までにTras1、R1Bm、Sart1、R2Bm、R7のORF2p全長の発現ベクター構築を行い、発現を確認したところ、Sart1以外殆ど発現していないことが分った。これを踏まえ、新たにEN-Mybドメインの発現ベクターを構築した。用いたのはヒトL1、Tras1、R1Bm、Sart1、R2Bm、R7のHisタグ及びGSTタグを構築し、それぞれCodon Plus宿主に入れて発現を確認したが、Sart1以外では殆ど発現しなかった。Tras1に関しては、Mybの長さを変えて1-476、1-458、1-438、1-428残基までの4種類のコンストラクトを構築したが、Hisタグでは全滅、GSタグでも1-428以外は発現が見られなかった。そこでGST-Tras1(1-428)の精製を検討したところ、タグを切断すると速やかに分解されてしまうことが分った。そこでGST-Sart1_EN-Mybについて精製を検討したところ、3Cプロテアーゼによるタグ切断の効率が低い上に沈殿しやすいことが分った。多くのコンストラクトで発現が見られないか、非常に低い点については、大腸菌の稀コドンが多く含まれていることが考えられる。またコンストラクトの設計が不適切で、タンパク質が分解されやすい位置に停止コドンを入れてしまっていることが考えられる。改善策として、これまでの研究経過を鑑みると大腸菌での発現から離れた方が良いと思われる。そこで本年度は昆虫細胞を用いた発現系の構築を行う。Tras1やR1Bmは蚕由来であるので、大腸菌よりも安定に発現することが期待できる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
当初の計画では結晶構造解析まで行う予定であったが、最初の段階の精製が上手くいっていないため、計画の半分も達成していない。発現させる領域が長く、サブクローニングに時間がかかってしまったことと、大腸菌での発現に拘ったことが理由である。結晶が出るまで時間がかかったとしても、良質の回折データが得られれば構造解析までは４か月程度で終了出来るので、３年を通しての目標達成は可能であると考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
２４年度は昆虫細胞を用いた発現系を構築する。常法であるヨトウガ（Sf9）を行うが、同時に蚕個体を用いた発現系も試みる。恒温振盪培養器などそのために必要な機材は新たに購入する。プラスミドなど発現系に必要な遺伝子は共同研究先である東大藤原研から供与していただくほか、自研究室で新たに構築する。昆虫細胞の培養の手法を習得するため、当手法を行っている京大白川研または東大藤原研へ年３回程度出張する。出来るだけ２４年度内に精製を完了し、結晶化まで行い、２５年度には構造を明らかにしたい。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
繰越しの理由としては、（１）結晶が得られなかったため、予定よりも放射光施設への出張回数が少なかった、（２）事務から戻された間接経費の額が予想以上であった、ことがあげられる。２４年度は繰越し分も合わせて、当初の研究計画には無かった昆虫細胞を用いた発現系の構築に必要な機材を購入する。そのうち、備品は恒温振盪培養器で、TAITEC社のBR-22FP・MR（\590,000）を一つ購入予定である。消耗品としては昆虫細胞培養用培地、試薬、フラスコ、プレート等、合わせて\500,000程度を使用する。また東大への出張が\180,000、京大への出張が\120,000程度を予定している。
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Research Products
(3 results)
