ＴＡＭ受容体チロシンキナーゼのリガンド認識機構の解明と創薬に向けた分子基盤

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 23570146
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 永田 崇 京都大学, エネルギー理工学研究所, 准教授 (10415250)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 高橋 栄夫 横浜市立大学, その他の研究科, 教授 (60265717)
• Keywords: TAM受容体 / NMR / 糖鎖修飾

Research Abstract

TAM受容体チロシンキナーゼTyro3について、標的分子であるGas6との結合解析を進めた。これまでの解析で見出した、Tyro3のホモダイマー化を解消する変異体Tyro3 NRと糖鎖修飾化された野生型Tyro3を解析の対象とした。なお、野生型Tyro3とTyro3 NRのGas6との結合の強さが同程度であることはSPRにより明らかにしている。大腸菌とK.lactisを用いてそれぞれ糖鎖修飾が無いTyro3 NRと、糖鎖修飾があるGlycoTyro3を調製し、Gas6についてはヒト細胞から調製した。まず、Tyro3 NRとGlycoTyro3のNMR解析を進め、主鎖[15N,1H]化学シフトの帰属がほぼ完了した。glycoTyro3については糖鎖切断を行い、糖鎖の有無でスペクトルを比較し、構造に大きな違いはないことを確認した。また、glycoTyro3とTyro3 NRのスペクトルの比較から、アミノ酸配列から予想された部位に糖鎖が付加されていることを確認出来た。さらに、Transferred Cross Saturation法を用いてTyro3 NR上のGas6結合部位を同定することにも成功し、その結果、Gas6結合部位と糖鎖修飾部位が互いに異なることが強く示唆された。この結果は、前年度に行ったSPRとゲルろ過による結合解析の結果を支持している。一方、もう一つのTAM受容体チロシンキナーゼMerについてはK. lactisによる大量調製方法の確立に成功したものの、選択的安定同位体標識化を試みたが、目的アミノ酸の標識効率が低いという問題に直面した。そこで、計画を変更してまずは標識効率を上げることが出来る系を開発した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

Tyro3については、糖鎖修飾、構造及び機能に関する知見を積み重ねてきている。一方Merについては、これまでの試料調製やNMRに関する各種条件検討の結果、選択的安定同位体標識化が必要なことが示された。Merもまた糖鎖修飾の有無で構造と機能を調べる必要があるため、糖鎖の付加が可能なK.lactisによる調製を試みてきた。しかし、いくつかのメチル基を有するアミノ酸残基の選択的安定同位体標識化の効率が低いことが明らかとなった。今年度は共同研究者が中心となりK.lactisによる選択的安定同位体標識化及び重水素化の検討が行われ、方法が確立された。今後はこれを用いてMerの選択的安定同位体標識化を目指す。

Strategy for Future Research Activity

平成２５年度に確立したK. lactisによる目的アミノ酸を効率良く選択的に安定同位体標識化することが出来る系を用いて、Merの各種選択的安定同位体標識化及び大量調製を行なう。またそれを用いてNMR解析を行う。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

平成２５年度にMerのK. lactisによる選択的安定同位体標識化、大量調製、NMR解析を行い、その結果と結合実験のデータを基に結合様式を明らかにするとともに、国際学会で発表する予定であった。しかし、目的アミノ酸の標識化効率が低いことが明らかとなり、計画を変更して効率を上げるための系を開発し、その系を用いてMerの選択的標識化及び大量調製、NMR解析を行うこととしたため、未使用額が生じた。
このため、平成２５年度に確立した目的アミノ酸を効率良く選択的に安定同位体標識化することが出来る系を用いて、Merの各種選択的安定同位体標識化及び大量調製、NMR解析を行い、国際学会での発表を次年度に行うこととし、未使用額はその経費に充てることにしたい。

Research Products

• [Journal Article] Quantitative analysis of the location- and sequence-dependent deamination by APOBEC3G using real-time NMR (2014)
  • Author(s): Furukawa, A., Sugase, K., Morishita, R., Nagata, T., Kodaki, T., Takaori, A., Ryo, A., Katahira, M.
  • Journal Title: Angew. Chem., Int. Ed. Volume: 53 Pages: 2349-2352
  • DOI: 10.1002/anie.201309940.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Structure-based approach to improve a small-molecule inhibitor by the use of a competitive Peptide ligand. (2014)
  • Author(s): Ono K, Takeuchi K, Ueda H, Morita Y, Tanimura R, Shimada I, Takahashi H.
  • Journal Title: Angew. Chem., Int. Ed. Volume: 53 Pages: 2597-2601
  • DOI: 10.1002/anie.201310749.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Biomol. NMR Assign. (2013)
  • Author(s): Nagata, T., Tsuda, K., Kobayashi, N., Guntert, P., Yokoyama, S., and Muto, Y.
  • Journal Title: (1)H, (13)C, and (15)N resonance assignments of the dsRBDs of mouse RNA helicase A. Volume: 7 Pages: 69-72
  • DOI: 10.1007/s12104-012-9380-3.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Rapid identification of ligand-binding sites by using an assignment-free NMR approach. (2013)
  • Author(s): Kodama Y, Takeuchi K, Shimba N, Ishikawa K, Suzuki E, Shimada I, Takahashi H.
  • Journal Title: J Med Chem. Volume: 56 Pages: 9342-9350
  • DOI: 10.1021/jm4014357.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Perdeuteration and methyl-selective (1)H, (13)C-labeling by using a Kluyveromyces lactis expression system. (2013)
  • Author(s): Miyazawa-Onami M, Takeuchi K, Takano T, Sugiki T, Shimada I, Takahashi H.
  • Journal Title: J Biomol NMR. Volume: 57 Pages: 297-304.
  • DOI: 10.1007/s10858-013-9789-8.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] NMRでリガンド分子の活性部位を探索する (2013)
  • Author(s): 高橋栄夫
  • Journal Title: 化学 Volume: 68 Pages: 39-43
• [Presentation] Statistical Thermodynamics for The Molecular Recognition Accompanied by a Global Structural Change of a Molecule (2014)
  • Author(s): Tomohiko HAYASHI, Hiraku OSHIMA, Tsukasa MASHIMA, Takashi NAGATA, Masato KATAHIRA, Masahiro KINOSHITA
  • Organizer: Nagoya Symposium on Deplection Forces: Celebrating the 60th Anniversary of the Asakura-Oosawa Theory
  • Place of Presentation: 名古屋大学（名古屋市）
  • Year and Date: 20140314-20140315
• [Presentation] Statistical Thermodynamics for Binding of an RNA Aptamer and a Partial Peptide of a Prion Protein (2014)
  • Author(s): Tomohiko HAYASHI, Hiraku OSHIMA, Tsukasa MASHIMA, Takashi NAGATA, Masato KATAHIRA, Masahiro KINOSHITA
  • Organizer: 58th Annual Meeting of the Biophysical Society of USA
  • Place of Presentation: Moscone Center (USA)
  • Year and Date: 20140215-20140219
• [Presentation] 神経系幹細胞の未分化状態維持に関わる Musashi1 タンパク質の機能発現の分子メカニズム (2013)
  • Author(s): 岩岡諒、 櫻井悠子、 鍵矢悦久、 今井貴雄、 岡野栄之、 永田崇、 片平正人
  • Organizer: 第36回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 神戸ポートアイランド（神戸市）
  • Year and Date: 20131203-20131206
• [Presentation] Development of quadruplex hammerhead ribozyme which switches on its ribozyme activity: introduction of quadruplex-forming complementary DNA to repress a basal activity (2013)
  • Author(s): Yudai Yamaoki, Tsukasa Mashima, Takashi Nagata, Masato Katahira
  • Organizer: 第36回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 神戸ポートアイランド（神戸市）
  • Year and Date: 20131203-20131206
• [Presentation] 四重鎖構造を形成する核酸の抗プリオン活性 (2013)
  • Author(s): 真嶋司、西川富美子、鎌足雄司、才村正幸、永田崇、西川諭、桑田一夫、片平正人
  • Organizer: 第36回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 神戸ポートアイランド（神戸市）
  • Year and Date: 20131203-20131206
• [Presentation] ヒト抗ウィルス因子 APOBEC3G の基質認識機構及び Vif による APOBEC3G 阻害機構の解明に向けて (2013)
  • Author(s): 神庭圭佑、永田崇、片平正人
  • Organizer: 第36回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 神戸ポートアイランド（神戸市）
  • Year and Date: 20131203-20131206
• [Presentation] mRNA ディスプレイ法により選択された高親和性MDM2結合ペプチドＭＩＰに基づくＭＤＭ2－ｐ53相互作用阻害剤の開発 (2013)
  • Author(s): 白川貴恵、永田崇、小林直弘、始平堂弘和、新倉啓介、片平正人、堀澤健一、土居信英、柳川弘志
  • Organizer: 第36回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 神戸ポートアイランド（神戸市）
  • Year and Date: 20131203-20131206
• [Presentation] 転写因子AML1に対して複数の結合部位を持つ高親和性RNAアプタマーの解析 (2013)
  • Author(s): 天野亮、野村祐介、永田崇、森瑶子、福永淳一、田中陽一郎、片平正人、中村義一、神津知子、坂本泰一
  • Organizer: 第36回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 神戸ポートアイランド（神戸市）
  • Year and Date: 20131203-20131206
• [Presentation] Origin of the anti-prion activity of quadruplex (2013)
  • Author(s): Tsukasa Mashima, Fumiko Nishikawa, Yuji O. Kamatari, Masayuki Saimura, Takashi Nagata, Satoshi Nishikawa, Kazuo Kuwata, Masato Katahira
  • Organizer: The 40th International Symposium on Nucleic Acids Chemistry 2013
  • Place of Presentation: 神奈川大学（横浜市）
  • Year and Date: 20131113-20131115
• [Presentation] Dual-quadruplex forming ribozyme distinctly switches on its activity in response to K+ (2013)
  • Author(s): Yudai Yamaoki, Tsukasa Mashima, Takashi Nagata, Masato Katahira
  • Organizer: The 40th International Symposium on Nucleic Acids Chemistry 2013
  • Place of Presentation: 神奈川大学（横浜市）
  • Year and Date: 20131113-20131115
• [Presentation] Multi-site binding of high affinity aptamer against AML1 Runt domain (2013)
  • Author(s): Ryo Amano, Yusuke Nomura, Takashi Nagata, Naohiro Kobayashi, Yoko Mori, Junichi Fukunaga, Yoichiro Tanaka, Masato Katahira, Yoshikazu Nakamura, Tomoko Kozu, Taiichi Sakamoto
  • Organizer: The 40th International Symposium on Nucleic Acids Chemistry 2013
  • Place of Presentation: 神奈川大学（横浜市）
  • Year and Date: 20131113-20131115
• [Presentation] Structural basis for the inhibition of MDM2:p53 interaction by highly selective MDM2-binding peptide obtained with IVV method (2013)
  • Author(s): Takashi Nagata, Kie Shirakawa, Naohiro Kobayashi, Hirokazu Shiheido, Masato Katahira, Kenishi Horisawa, Nobuhide Doi, Hiroshi Yanagawa
  • Organizer: 第52回日本核磁気共鳴学会
  • Place of Presentation: 石川県立音楽堂（金沢市）
  • Year and Date: 20131112-20131114
• [Presentation] Aptamer that exerts anti-prion activity and intelligent ribozyme whose activity awitches in reponse to K+ (2013)
  • Author(s): Masato Katahira, Tsukasa Mashima, Yudai Yamaoki, Takashi Nagata, Fomiko Nishikawa, Satoshi Nishikawa, Yuji Kamatari, Kazuo Kuwata
  • Organizer: 日本生物物理学会第51回年会
  • Place of Presentation: 京都大学（京都市）
  • Year and Date: 20131028-20131030
• [Presentation] Statistical Thermodynamics for Binding of an RNA Aptamer and a Partial Peptide of a Prion Protein (2013)
  • Author(s): Tomohiko HAYASHI, Hiraku OSHIMA, Tsukasa MASHIMA, Takashi NAGATA, Masato KATAHIRA, Masahiro KINOSHITA
  • Organizer: 日本生物物理学会第51回年会
  • Place of Presentation: 京都大学（京都市）
  • Year and Date: 20131028-20131030
• [Presentation] Structual description for the strong binding of the peptide selected by mRNA display to MDM2 (2013)
  • Author(s): Takashi Nagata, Kie Shirakawa, Naohiro Kobayashi, Hirokazu Shiheido, Masato Katahira, Kenishi Horisawa, Nobuhide Doi, Hiroshi Yanagawa
  • Organizer: 5th Asia-Pacific NMR Symposium
  • Place of Presentation: Brisbane Convention and Exhibition Centre (Australia)
  • Year and Date: 20131027-20131030
• [Presentation] NMR analysis of the interaction between an artificial RNA and atranscription factor (2013)
  • Author(s): Ryo Amano, Yusuke Nomura, Takashi Nagata, Naohiro Kobayashi, Yoko Mori, Junichi Fukunaga, Yoichiro Tanaka, Masato Katahira, Yoshikazu Nakamura, Tomoko Kozu, taiichi Sakamoto
  • Organizer: The 4th International Symposium of Advanced Energy Science
  • Place of Presentation: 京都大学（宇治市）
  • Year and Date: 20130930-20131002
• [Presentation] 脳の機能を妨害する天然変性蛋白質とそれを標的とするアプタマーの分子認識機構の解明 (2013)
  • Author(s): 永田 崇
  • Organizer: 新学術領域研究「天然変性タンパク質の分子認識機構と機能発現」平成24年度 第4回 領域会議
  • Place of Presentation: ひだホテルプラザ（高山市）
  • Year and Date: 20130903-20130905
  • Invited
• [Presentation] カリウムイオンによって活性がスイッチングする四重鎖リボザイムの創製：四重鎖形成相補鎖によるスイッチング性能の向上 (2013)
  • Author(s): 山置佑大、真嶋司、永田崇、片平正人
  • Organizer: 第15回日本RNA学会年会
  • Place of Presentation: ひめぎんホール（松山市）
  • Year and Date: 20130724-20130726
• [Presentation] The deamination of APOBEC3G is controlled by the sliding-direction-dependent catalytic activity, and anti-prion activity of an RNA aptamer and its structual basis (2013)
  • Author(s): Ayako Furukawa, Kenji Sugase, Ryo Morishita, Takashi Nagata, Akifumi Takaori-Kondo, Akihide Ryo, Tsukasa Mashima, Fomiko Nishikawa, Satoshi Nishikawa, Yuji Kamatari, Kazuo Kuwata, Masato Katahira
  • Organizer: The 10th Korea-Japan Bilateral Symposium on Biological NMR
  • Place of Presentation: Seoul Univ. (Korea)
  • Year and Date: 20130704-20130704
• [Presentation] Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ of high affinity and anti-prion activity of anti-prion aptamer (2013)
  • Author(s): Tsukasa Mashima, Fomiko Nishikawa,Yuji O kamatari, Hiromichi Fujiwara, Masayuki Saimura, Takashi Nagata, Tsutomu Kodaki, Satoshi Nishikawa, Kazuo Kuwata, Masato Katahira
  • Organizer: The 10th Korea-Japan Bilateral Symposium on Biological NMR
  • Place of Presentation: Seoul Univ. (Korea)
  • Year and Date: 20130704-20130704
• [Presentation] 転写因子AML1を標的としたRNAアプタマーによるDNAの擬態 (2013)
  • Author(s): 天野亮，野村祐介，永田崇，森瑶子，福永淳一，田中陽一郎，片平正人，中村義一，神津知子，坂本泰一
  • Organizer: 第8回日本ケミカルバイオロジー学会
  • Place of Presentation: 東京医科歯科大学M&Dタワー（東京都）
  • Year and Date: 20130619-20130621
• [Presentation] NMR実時間計測法により抗ウィルス因子APOBEC3Gのシチジン脱アミノ化反応の配列依存性を評価する (2013)
  • Author(s): 神庭圭佑、 小瀧努、 永田崇、 片平正人
  • Organizer: 第13回日本蛋白質科学学会年会
  • Place of Presentation: とりぎん文化会館（鳥取市）
  • Year and Date: 20130612-20130614
• [Presentation] プリオン蛋白質を標的とするＲＮＡアプタマーの認識メカニズムとその抗プリオン活性 (2013)
  • Author(s): 真嶋司，西川富美子，鎌足雄司，藤原弘道，遠藤美紗, 永田崇，小瀧努，西川諭，桑田一夫，片平正人
  • Organizer: 第13回 日本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: とりぎん文化会館（鳥取市）
  • Year and Date: 20130612-20130614