2013 Fiscal Year Annual Research Report
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23580127
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| Research Institution | Yamagata University |
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Principal Investigator |
三橋 渉 山形大学, 農学部, 教授 (50192761)
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| Keywords | 細胞周期 / 細胞周期停止因子 / シロイヌナズナ / KRP |
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| Research Abstract |
AtKRP3と相互作用候補タンパク質のプルダウン・アッセイ：AtKRP3は不安定なタンパク質で、種々検討により平成24年度より導入した大腸菌異所発現系(大腸菌：Bl21派生株Rosetta株, 低温条件下で数時間発現)で少量ながら生産できるようになった。AtKRP3はGSTタグとの融合体として生産し、グルタチオン・セファロースで回収した。セファロースから溶出すると分解が進み、結合状態では安定であった。そこで、同セファロースとの結合状態でプルダウン・アッセイを行なった。対象には結合候補の核コード葉緑体タンパク質数種を選び、コムギ胚芽無細胞転写・翻訳後、GST-AtKRP3を混合、回収した。しかし、電気泳動後のCBB染色では検出できなかった。候補タンパク質のうち、大腸菌で比較的安定して生産できるホルモン関連因子に注目し、Hisタグ融合タンパク質として発現させ、GST-AtKRP3に対してプルダウン・アッセイを行なった。その結果、有意な結合が観察された。このタンパ質について酵母ツーハイブリッド法によりAtKRP3との結合領域をドメインレベルで決定した。
BiFC法によるAtKRP３と葉緑体タンパク質の相互作用：AtKRP3および結合候補の核コード葉緑体タンパク質数種についてpUCJ4-eYFPに組み込み、シロイヌナズナT87培養細胞に形質転換後、YFPの再構成によって生じる蛍光を指標に結合の有無と細胞内局在を観察した。その結果、いくつかの葉緑体タンパク質において葉緑体に隣接した細胞質でYFP蛍光が観察された。
AtKRP3過剰発現体の選抜：平成24年度に調製したAtKRP3過剰発現体のライン化を進めた。同変異体は矮性を示し、既に報告されているAtKRP1やAtKRP2の過剰発現体と同様に成熟葉の形態が楕円型から鋸型に変化していた。また、花芽形成が非常に遅く、ホモ体の選抜は遅れている。
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