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2011 Fiscal Year Research-status Report

新規リン脂質代謝酵素GDE5の生理機能の解明、およびその応用

Research Project

Project/Area Number 23580134
Research InstitutionHiroshima University

Principal Investigator

矢中 規之  広島大学, 生物圏科学研究科, 准教授 (70346526)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 加藤 範久  広島大学, 生物圏科学研究科, 教授 (20144892)
和田 正信  広島大学, 総合科学研究科, 教授 (80220961)
Project Period (FY) 2011-04-28 – 2014-03-31
KeywordsC2C12細胞 / glycerophosphocholine / choline / 骨格筋細胞 / 筋分化
Research Abstract

以前、培養筋芽細胞株C2C12細胞におけるGDE5の発現抑制によって、myogeninの発現や筋管形成が著しく促進することを明らかにしていることから、GDE5の発現抑制による骨格筋細胞の分化誘導効果のメカニズムの解明に着手した。まず、GDE5が細胞内のglycerophosphocholine(GroPCho)を分解し、choline(Cho)を生成する可能性について、LC/MS法を用いた細胞内GroPCho、およびChoの測定系を構築した。C2C12細胞におけるGDE5の発現抑制によって、細胞内のGroPChoは著しく蓄積し、さらにChoは減少したことから、in vitroのみならず、細胞内においてもGroPChoからChoへの変換に関与することが示された。また、GDE5の発現抑制においてrapamycinの投与によってmyogeninの発現や筋管形成が抑制され、GDE5の発現抑制による筋分化促進作用におけるmTOR系の関与が示唆された。さらに、DNA microarray法を用いて、C2C12細胞におけるGDE5の発現抑制によって、IGF2遺伝子やproteoglycan遺伝子の著しい発現誘導が認められた。一方、動物細胞における GDE5の過剰発現によって,GroPChoの分解活性を確認しており、GDE5のN末端にHis tagあるいはstrep tagを融合させてHEK293T細胞で過剰発現させ,アフィニティ精製を試みたが、組換えGDE5タンパク質の精製は困難であった。そこで、天然型組換えGDE5タンパク質を発現させ、イオン交換クロマトグラフィーによって部分精製を行い、GroPChoの分解活性の確認が終了した。同組換えGDE5タンパク質のGroPChoの分解活性を利用して,化合物のスクリーニングに着手する予定である.

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

培養筋芽細胞株C2C12細胞のGDE5の発現抑制による筋分化誘導効果のメカニズムの解明において、遺伝子解析など順調に推移している。一方、LC/MS法を用いたglycerophosphocholine(GroPCho)、およびcholine(Cho)の測定系の構築を行った。本測定系によって細胞内におけるGroPChoからChoへの変換にGDE5が関与することが示され、筋細胞分化との関連性について貴重な情報を与えるものであり、また阻害物質のスクリーニング法においても利用可能であり、大きく貢献するものである。動物細胞におけるN末端tagを付加したGDE5の過剰発現によってアフィニティ精製を試みたが、組換えGDE5タンパク質の精製は困難であった。しかし、天然型組換えGDE5タンパク質のイオン交換クロマトグラフィーによる部分精製に到達し、GroPChoの分解活性を指標とした化合物のスクリーニング法に利用可能であることが示された.

Strategy for Future Research Activity

GDE5阻害による筋分化誘導システムの解明においては、筋芽細胞株C2C12細胞に与える影響のみならず、筋分化能を有さないマウス線維芽細胞株NIH-3T3細胞において、siRNA法によってGDE5を発現抑制させ、DNA microarray法による遺伝子解析を行う。C2C12細胞の遺伝子解析では,筋細胞分化促進作用に伴った二次的な遺伝子発現変動が多く混在するため,遺伝子発現を比較解析することによってGDE5阻害に基づく一次的な因子群の絞り込みを行う。GDE5阻害活性による化合物スクリーニングに着手する。LC/MS法を用いたglycerophosphocholine(GroPCho)、およびcholine(Cho)の測定系を利用する。富山大学・和漢医薬学総合研究所の生薬由来化合物ライブラリー(80種),および生薬エキスライブラリー(120種),また理研NPDepoの標準化合物ライブラリー(80種,Authentic Library)をスクリーニングに用いる。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

GDE5阻害による筋分化誘導システムの解明においては、マウス線維芽細胞株NIH-3T3細胞を用いてsiRNA法によってGDE5を発現抑制させ、DNA microarray法による遺伝子解析を行う。その際のLC/MS法を用いたcholine代謝物の解析やDNA microarray法による遺伝子解析などの消耗品類に使用する。GDE5阻害活性による化合物スクリーニングにおいても、LC/MS法による測定に関わる消耗品類、また酵素精製に関わる消耗品類に使用する。

  • Research Products

    (5 results)

All 2012 2011

All Journal Article (2 results) (of which Peer Reviewed: 2 results) Presentation (3 results)

  • [Journal Article] Vitamin B6 suppresses serine protease inhibitor 3 expression in the colon of rats and in TNF-α-stimulated HT-29 cells.2011

    • Author(s)
      Yanaka N, Ohata T, Toya K, Kanda M, Hirata A, Kato N.
    • Journal Title

      Mol. Nutr. Food Res.

      Volume: 55 Pages: 635-643

    • DOI

      10.1002/mnfr.201000282

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Fish oil feeding up-regulates the expression of 5-aminolevulinate synthase 2 mRNA in rat brain.2011

    • Author(s)
      Haraguchi T, Yanaka N, Eguchi Y, Kudo T, Hirata A, Kato N.
    • Journal Title

      Biosci. Biotechnol. Biochem.

      Volume: 75 Pages: 1383-1385

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] 脂肪細胞における細胞内コリンの新規供給経路2012

    • Author(s)
      中村啓司、吉田円、吉澤郁美、廣崎晴香、加藤範久、矢中規之
    • Organizer
      日本農芸化学会大会
    • Place of Presentation
      京都女子大
    • Year and Date
      2012年3月25日
  • [Presentation] 肥満において単球・マクロファージとの相互作用により脂肪細胞で応答する因子群の探索2012

    • Author(s)
      久本高央、真田洋平、米中久喜、加藤範久、西村英紀、矢中規之
    • Organizer
      日本農芸化学会大会
    • Place of Presentation
      京都女子大
    • Year and Date
      2012年3月25日
  • [Presentation] 脂肪細胞におけるRASSF6の発現はマクロファージとの相互作用によって減少する2012

    • Author(s)
      真田洋平、久本高央、米中久喜、西村英紀、畑裕、矢中規之
    • Organizer
      日本農芸化学会大会
    • Place of Presentation
      京都女子大
    • Year and Date
      2012年3月25日

URL: 

Published: 2013-07-10  

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