酸化ストレス誘導性の肝腫瘍原性遺伝子に関する機能解析：分子標的治療への基礎的検討

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 23590995
• Research Institution: Jikei University School of Medicine
• Principal Investigator: 坪田 昭人 東京慈恵会医科大学, 医学部, 教授 (90322643)
• Keywords: 肝発癌 / 酸化ストレス / 肝腫瘍原性遺伝子 / 網羅的遺伝子発現解析 / mRNA / microRNA / siRNA

Research Abstract

肝発癌は持続的肝傷害や線維化と密接に関連しており、その発癌過程は多段階的であり、膨大な数の遺伝子が複雑に相互関連している。持続的な肝傷害の原因も肝炎ウイルスや脂肪性・アルコール性など様々で、その発癌過程に分子生物学的相違が指摘されている。しかし長期の炎症状態と持続的な酸化ストレスへの曝露は共通の病態であり、そのような状態から誘導される遺伝子の一部は、多様性のある多段階的肝発癌に最も共通して関与する肝腫瘍原性遺伝子の可能性は高い。本研究の目的は、申請者が報告してきた酸化ストレス誘導性肝腫瘍原性遺伝子の機能を解析することである。
酸化ストレス誘導性の肝腫瘍原性遺伝子のうち、申請者が注目してきたIQGAP1及びvimentinのヒト肝癌細胞株におけるmRNA/蛋白発現状況を明らかにした。各々が高発現している細胞株においてsiRNA導入により効率良くknockdownする系を既に確立した。これらの遺伝子がknockdownされることで変動する関連遺伝子についてmRNA/microRNAの網羅的解析を行い、詳細な解析後に公的機関に登録する。更にmRNAとmicroRNAとの相互関連性について詳細な検討を行っている。
遊走能・浸潤能のある細胞株に対するIQGAP1のknockdownは、その活動能が著しく低下する細胞株とそれ程低下しない細胞株に分かれた。IQGAP1高発現株は、より低分化で遊走能・浸潤能が高く、その中心的役割をIQGAP1が担っていると考えられた。Vimentinも異なる細胞株で中心的役割を果たしていることが示唆され、遊走能・浸潤能の低下には違った遺伝子をknockdownすることが有効と考えられた。最近、腫瘍促進性のIQGAP1が、大腸癌の転移性肝癌を抑制する可能性が新たに報告された。そのため、延長申請した最終年度は発癌促進・抑制の両面から検討する。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

ヒト肝癌細胞株において、IQGAP1及びvimentinに対するsiRNAにより効率良くknockdownできる系を確立した。この系では効率的にIQGAP1あるいはvimentinをknockdownすることで遊走能・浸潤能を低下させることを確認している。またこれらの遺伝子をknockdownさせることで変動するmicroRNA及びmRNAに関して網羅的解析を行った。In silicoによるputative microRNA targetsが逆相関している遺伝子に関して、そのvalidationを繰り返し行っているところである。予想外の新たな知見もあり、予定されていなかった検討・解析を行っていることで、癌遊走能・浸潤能やそれに関与する遺伝子の新たな機能や調整機構が明らかにされる可能性もある。実験が故の予想外の結果に対する検証も行われているのが現状であり、当初の予定よりやや遅れていると考えている。最近、腫瘍促進遺伝子と考えらえているIQGAP1が、大腸癌の転移性肝癌を抑制していることが新たに報告された。そのため、同遺伝子の発癌促進・抑制の両面から検討も行いつつある。

Strategy for Future Research Activity

IQGAP1の発現に関与するmicroRNAやIQGAP1に直接的に関連するmRNAについて、さらに詳細な検討を進め、その調整機序を解明していく。それら遺伝子群の関連性を各々の遺伝子に対するknockdown及び細胞内導入による過剰発現により細胞機能や細胞形態がどのように変化するのか、また他の遺伝子にどう影響するのかについて検討する。また、IQGAP1等の主要な遺伝子の発現をさらに効率良く抑制する方法：microRNAの細胞内導入、siRNAの改良やdeliveryの手段等についても研究を継続する。
遊走能・浸潤能の癌細胞に特有の機能に関与する遺伝子と各々が果たしている役割について解析・検討し、癌細胞の遊走・浸潤機序を明らかにする。また、これら遺伝子が癌細胞の悪性度進展にどう関与しているかを検討することで、どのように癌細胞が遊走能・浸潤能を獲得していくかについて明らかにしていく。これらを解明していくことで、しばしばみられる抗癌剤への感受性低下の機序や抗癌剤効果を増強させる補助的手段についても検討を行う。また、最近、腫瘍促進遺伝子と考えられていたIQGAP1が、大腸癌の転移性肝癌において癌抑制遺伝子として働いている可能性が新たに示唆された。この側面も考慮して、発癌促進・抑制の両面から検討を行う。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

種々の癌原遺伝子として研究されてきた当該遺伝子において、まったく正反対の論文が発表された（J Clin Invest. 2013;123:1138-56）。IQGAP1が肝非実質細胞においてTGF-beta受容体IIを介した線維芽細胞のTGF-beta依存性活性化を抑制、また癌転移性も抑制するとの報告である。そのため、一旦実験を中断し、今までのデータを再解析・再検討している。よく吟味したうえで、必要な追加実験や解釈を加えたうえで、残りの研究費と延長期間を有益に使うことを考えている。
上述の通り、今までのデータを再解析・再検討しているとともに、結果の相違を説明するうえで必要な項目等を慎重に吟味している。重要事項に優先順位を付け、優先度の高い項目に対して貴重な研究費を重点的に使用する予定である。現時点では、肝細胞由来細胞株と肝非実質性細胞由来株との相違を検討する使用を考えている。

Research Products

• [Journal Article] A 48-week telaprevir-based triple combination therapy improves sustained virological response rate in previous non-responders to peginterferon and ribavirin with genotype 1b chronic hepatitis C: A multicenter study. (2014)
  • Author(s): Shimada N, Tsubota A, Atsukawa M, Abe H, Ide T, Takaguchi K, Chuganji Y, Toyoda H, Yoshizawa K, Ika M, Sato Y, Kato K, Kumada T, Sakamoto C, Aizawa Y, Sata M.
  • Journal Title: Hepatol Res Volume: 2014 Mar (Epub ahead of print) Pages: 印刷中
  • DOI: 10.1111/hepr.12323
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Serum 25-hydroxy- vitamin D3 levels affect treatment outcome in pegylated-interferon/ ribavirin combination therapy for compensated cirrhotic patients with HCV genotype 1b and high viral load. (2014)
  • Author(s): Atsukawa M, Tsubota A, Shimada N, Kondo C, Itokawa N, Nakagawa A, Hashimoto S, Fukuda T, Matsushita Y, Narahara Y, Iwakiri K, Nakatsuka K, Kawamoto C, Sakamoto C.
  • Journal Title: Hepatol Res Volume: 2014 Jan (Epub ahead of print) Pages: 印刷中
  • DOI: 10.1111/hepr.12298
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] α-Fetoprotein is a surrogate marker for predicting treatment failure in telaprevir-based triple combination therapy for genotype 1b chronic hepatitis C Japanese patients with the IL28B minor genotype. (2014)
  • Author(s): Shimada N, Tsubota A, Atsukawa M, Abe H, Ika M, Kato K, Sato Y, Kondo C, Sakamoto C, Tanaka Y, Aizawa Y.
  • Journal Title: J Med Virol Volume: 86 Pages: 461-472
  • DOI: 10.1002/jmv.23824
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Impact of IL28B polymorphisms on 24-week telaprevir-based combination therapy for Asian chronic hepatitis C patients with hepatitis C virus genotype 1b. (2014)
  • Author(s): Tsubota A, Shimada N, Atsukawa M, Abe H, Kato K, Ika M, Matsudaira H, Nagatsuma K, Matsuura T, Aizawa Y.
  • Journal Title: J Gastroenterol Hepatol Volume: 29 Pages: 144-150
  • DOI: 10.1111/jgh.12402
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Risk factors for long-term persistence of serum hepatitis B surface antigen following acute hepatitis B virus infection in Japanese adults. (2014)
  • Author(s): Ito K, Yotsuyanagi H, Yatsuhashi H, Karino Y, Takikawa Y, Saito T, Arase Y, Imazeki F, Kurosaki M, Umemura T, Ichida T, Toyoda H, Yoneda M, Mita E, Yamamoto K, Michitaka K, Maeshiro T, Tanuma J, Tanaka Y, Sugiyama M, Murata K, Masaki N, Mizokami M; Japanese AHB Study Group (Appendix; Tsubota A).
  • Journal Title: Hepatology Volume: 59 Pages: 89-97
  • DOI: 10.1002/hep.26635
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Hepatic stellate cells that coexpress LRAT and CRBP-1 partially contribute to portal fibrogenesis in patients with human viral hepatitis. (2014)
  • Author(s): Nagatsuma K, Hano H, Murakami K, Shindo D, Matsumoto Y, Mitobe J, Tanaka K, Saito M, Maehashi H, Owada M, Ikegami M, Tsubota A, Ohkusa T, Aizawa Y, Takagi I, Tajiri H, Matsuura T.
  • Journal Title: Liver Int Volume: 34 Pages: 243-252
  • DOI: 10.1111/liv.12255
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Efficacy of alfacalcidol on PEG-IFN/ribavirin combination therapy for elderly patients with chronic hepatitis C: a pilot study. (2013)
  • Author(s): Atsukawa M, Tsubota A, Shimada N, Kondo C, Itokawa N, Nakagawa A, Hashimoto S, Fukuda T, Matsushita Y, Kidokoro H, Narahara Y, Nakatsuka K, Iwakiri K, Kawamoto C, Sakamoto C.
  • Journal Title: Hepat Mon Volume: 13 Pages: e14872
  • DOI: 0.5812/hepatmon.14872
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Sustained and rapid virological responses in hepatitis C clinical trials. (2013)
  • Author(s): Tsubota A, Furihata T, Matsumoto Y, Chiba K.
  • Journal Title: Clinical Investigation Volume: 3 Pages: 1083-1093
  • DOI: 10.4155/cli.13.98
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Baseline factors and very early viral response (week 1) for predicting sustained virological response in telaprevir-based triple combination therapy for Japanese genotype 1b chronic hepatitis C patients: a multicenter study. (2013)
  • Author(s): Shimada N, Toyoda H, Tsubota A, Ide T, Takaguchi K, Kato K, Kondoh M, Matsuyama K, Kumada T, Sata M.
  • Journal Title: J Gastroenterol Volume: 2013 Nov (Epub ahead of print) Pages: 印刷中
  • DOI: PMID 24287582
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Serum lipoprotein profiles and response to pegylated interferon plus ribavirin combination therapy in patients with chronic HCV genotype 1b infection. (2013)
  • Author(s): Aizawa Y, Shimada N, Abe H, Seki N, Aida Y, Ishiguro H, Ika M, Kato K, Tsubota A.
  • Journal Title: Hepat Mon Volume: 13 Pages: e8988
  • DOI: 10.5812/hepatmon.8988
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Serum apolipoprotein B-100 concentration predicts the virological response to pegylated interferon plus ribavirin combination therapy in patients infected with chronic hepatitis C virus genotype 1b. (2013)
  • Author(s): Yoshizawa K, Abe H, Aida Y, Ishiguro H, Ika M, Shimada N, Tsubota A, Aizawa Y.
  • Journal Title: J Med Virol Volume: 85 Pages: 1180-1190
  • DOI: 10.1002/jmv.23597
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] New proposal for response-guided peg-interferon-plus- ribavirin combination therapy for chronic hepatitis C virus genotype 2 infection. (2013)
  • Author(s): Abe H, Aida Y, Ishiguro H, Yoshizawa K, Seki N, Miyazaki T, Itagaki M, Sutoh S, Ika M, Kato K, Shimada N, Tsubota A, Aizawa Y.
  • Journal Title: J Med Virol Volume: 85 Pages: 1523-1533
  • DOI: 10.1002/jmv.23626
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Platelet count and sustained virological response in hepatitis C treatment. (2013)
  • Author(s): Kanda T, Kato K, Tsubota A, Takada N, Nishino T, Mikami S, Miyamura T, Maruoka D, Wu S, Nakamoto S, Arai M, Fujiwara K, Imazeki F, Yokosuka O.
  • Journal Title: World J Hepatol Volume: 5 Pages: 182-188
  • DOI: 10.4254/wjh.v5.i4.182
  • Peer Reviewed
• [Presentation] IL28B gene and very early viral kinetics (Week-1) predict sustained virological response to triple therapy in chronic hepatitis C patients with genotype 1b and high viral load. (2013)
  • Author(s): Ide T, Sata M, Takaguchi K, Toyoda H, Kumada T, Shimada N, Kato K, Tsubota A, Izumi N.
  • Organizer: The Liver Meeting, The 64th Annual Meeting of the AASLD 2013
  • Place of Presentation: Washington, DC, USA
  • Year and Date: 20131101-20131105
• [Presentation] 早期ウイルス動態からのTelaprevir３剤併用療法の治療効果予測の検討. (2013)
  • Author(s): 加藤慶三,島田紀朋,豊田秀徳,井出達也,坪田昭人,高口浩一,佐田通夫,泉 並木,熊田 卓
  • Organizer: 第17回日本肝臓学会大会
  • Place of Presentation: グランドホテル高輪・新高輪（東京都港区）
  • Year and Date: 20131009-20131010
• [Presentation] 脾腫を伴う血小板低値のC型慢性肝炎に対するPSE先行３剤併用療法の検討. (2013)
  • Author(s): 厚川正則,島田紀朋,坪田昭人,近藤千紗,糸川典夫,中川 愛,福田 健,楢原義之,安部 宏,相澤良夫,岩切勝彦,坂本長逸.
  • Organizer: 第17回日本肝臓学会大会
  • Place of Presentation: グランドホテル高輪・新高輪（東京都港区）
  • Year and Date: 20131009-20131010
• [Presentation] 血清アポリポプロテインE（apoE）値はHCV持続感染の病態に関与するか？ (2013)
  • Author(s): 相澤良夫,安部 宏,關 伸嘉,会田雄太,石黒晴哉,,島田紀行朋,坪田昭人.
  • Organizer: 第17回日本肝臓学会大会
  • Place of Presentation: グランドホテル高輪・新高輪（東京都港区）
  • Year and Date: 20131009-20131010
• [Presentation] C型慢性肝炎に対するTelaprevirを含む３剤併用療法における治療成績 (2013)
  • Author(s): 中川 愛,厚川正則,島田紀朋,坪田昭人,糸川典夫,近藤千紗,福田 健,松下洋子,楢原義之,中塚雄久,長田祐二,岩切勝彦,坂本長逸.
  • Organizer: 第17回日本肝臓学会大会
  • Place of Presentation: グランドホテル高輪・新高輪（東京都港区）
  • Year and Date: 20131009-20131010
• [Presentation] IL28BゲノタイプおよびHCV G1bコア70番アミノ酸置換から見たテラプレビル,リバビリン,ペグインターフェロン３剤併用療法の治療効果の検討. (2013)
  • Author(s): 安部 宏,島田紀朋,厚川正則,坪田昭人,関 伸嘉,会田雄太,石黒晴哉,井家麻紀子,加藤慶三,相澤良夫.
  • Organizer: 第49回日本肝臓学会総会
  • Place of Presentation: 京王プラザホテル（東京都新宿区）
  • Year and Date: 20130606-20130607
• [Presentation] 早期ウイルス動態からのTelaprevir 3剤併用療法の治療効果予測の検討. (2013)
  • Author(s): 加藤慶三,RGT研究会（坪田昭人）.
  • Organizer: 第49回日本肝臓学会総会
  • Place of Presentation: 京王プラザホテル（東京都新宿区）
  • Year and Date: 20130606-20130607
• [Presentation] TVR3剤併用療法のウイルス陰性化時期別の治療成績の検討. (2013)
  • Author(s): 島田紀朋,厚川正則,坪田昭人,安部 宏,加藤慶三,井家麻紀子,佐藤祥之,立花浩幸,米澤 健,戸田剛太郎,相澤良夫.
  • Organizer: 第49回日本肝臓学会総会
  • Place of Presentation: 京王プラザホテル（東京都新宿区）
  • Year and Date: 20130606-20130607
• [Presentation] C型慢性肝炎に対する3剤併用療法の治療効果に寄与する因子～スタチン併用も含め～. (2013)
  • Author(s): 中川 愛,厚川正則,島田紀朋,坪田昭人,近藤千紗,糸川典夫,福田 健,松下洋子,楢原義之,長田祐二,中塚雄久,岩切勝彦,坂本長逸.
  • Organizer: 第49回日本肝臓学会総会
  • Place of Presentation: 京王プラザホテル（東京都新宿区）
  • Year and Date: 20130606-20130607
• [Presentation] 血小板数低値のC型慢性肝炎に対するPSE先行3剤併用療法について. (2013)
  • Author(s): 近藤千紗,厚川正則,島田紀朋,坪田昭人,糸川典夫,中川 愛,橋本知実,福田 健,松下洋子,城所秀子,楢原義之,中塚雄久,金沢秀典,岩切勝彦,坂本長逸.
  • Organizer: 第49回日本肝臓学会総会
  • Place of Presentation: 京王プラザホテル（東京都新宿区）
  • Year and Date: 20130606-20130607
• [Presentation] C型慢性肝炎Genotype2に対する治療効果とIL28B遺伝子多型との関連性. (2013)
  • Author(s): 石黒晴哉,関 伸嘉,会田雄太,安部 宏,井家麻紀子,加藤慶三,島田紀朋,坪田昭人,相澤良夫.
  • Organizer: 第49回日本肝臓学会総会
  • Place of Presentation: 京王プラザホテル（東京都新宿区）
  • Year and Date: 20130606-20130607
• [Presentation] B型慢性肝炎に対するPeginterferon alfa-2a単独およびSequential Therapy施行時のHBs抗原量の推移に関する検討～多施設共同研究～. (2013)
  • Author(s): 神田達郎,厚川正則,島田紀朋,篠崎正美,三上繁,星野容子,加藤慶三,中本晋吾,千葉哲博,新井誠人,今関文夫,坪田昭人,横須賀収.
  • Organizer: 第49回日本肝臓学会総会
  • Place of Presentation: 京王プラザホテル（東京都新宿区）
  • Year and Date: 20130606-20130607