2011 Fiscal Year Research-status Report
大腸癌浸潤先進部ＣＥＡＣＡＭ１発現細胞を標的とした新規癌治療の開発
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23591904
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| Research Institution | Wakayama Medical University |
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Principal Investigator |
横山 省三 和歌山県立医科大学, 医学部, 講師 (90398462)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
堀田 司 和歌山県立医科大学, 医学部, 講師 (50244744)
瀧藤 克也 和歌山県立医科大学, 医学部, 准教授 (00254540)
松田 健司 和歌山県立医科大学, 医学部, 助教 (30398458)
山上 裕機 和歌山県立医科大学, 医学部, 教授 (20191190)
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| Project Period (FY) |
2011-04-28 – 2014-03-31
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| Keywords | CEACAM1 / 大腸癌 / 腺管形成 / 癌幹細胞 / 抗癌剤感受性 |
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| Research Abstract |
大腸癌発育先進部に浸潤性に形成する腺管のがん幹細胞分化および抗癌剤感受性におけるCEACAM1 isoform balanceの役割について検討するため、CEACAM1の発現およびisoform balanceによるがん幹細胞分化および腺管形成能、５FUの感受性について臨床的基礎的に検討している。現在までに臨床的には、化学放射線未施行例において直腸間膜内における浸潤性に存在する腺管形成が再発に関与する可能性があることが示唆された。今後さらに放射線抗癌剤感受性を直腸癌術前化学放射線療法の手術検体をもちいて直腸間膜内における浸潤性に存在する腺管形成が、放射線や抗癌剤感受性に抵抗性であるか否かを検討する予定である。５FU感受性について、CEACAM1 short cytoplasmic isoformの強制発現にて5FU感受性が増強することが示され、CEACAM1 long cytoplasmic isofrom の強制発現にて5FUに対して抵抗性となることが観察された。CEACAM1とがん幹細胞との関連について、大腸癌発育先進部間質のCEACAM1発現する中空を伴う球体がCD133を発現することから、CEACAM1の発現変化が、がん幹細胞の分に関連すると考えられる。大腸癌培養細胞HT29 またはLS174TのCEACAM1の発現を変化CD133、CD44、EpCAMの発現細胞数を定量的に評価し、腺管形成能について現在検討している。さらに、flow cytometryにてCD133、CD44、またはEpCAMの陽性陰性細胞をsortし、3次元培養にて腺管形成について検討し、CEACAM1の発現およびisoform balanceによるがん幹細胞分化誘導および腺管形成能との関連について検討しており、現在データ解析中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
現在までに臨床的には、化学放射線未施行例において直腸間膜内における浸潤性に存在する腺管形成が再発に関与する可能性があることが示唆された。今後さらに放射線抗癌剤感受性を直腸癌術前化学放射線療法の手術検体をもちいて直腸間膜内における浸潤性に存在する腺管形成（組織形成）が、放射線や抗癌剤感受性に抵抗性であるか否かを検討する予定である。抗癌剤感受性については術後補助化学療法を施行するStage III大腸癌においてCEACAM1発現hollow spheroidが再発や予後に関連することまた基礎的に５FU感受性について、CEACAM1 short cytoplasmic isoformの強制発現にて5FU感受性が増強することが示され、CEACAM1 long cytoplasmic isofrom の強制発現にて5FUに対して抵抗性となることが観察され、CEACAM1が抗癌剤の感受性に関与することが示された。
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| Strategy for Future Research Activity |
手術可能直腸癌に対し化学放射線療法を施行し、この手術摘出標本を用いてCD133, CD44, EpCAMの免疫組織化学にてがん幹細胞の存在およびその化学放射線療法抵抗性を検討する。大腸癌培養細胞HT29に CEACAM1-4LまたはCEACAM1-4Sを強発現するstable line、またCEACAM1-4Lを強発現する大腸癌培養細胞LS174TにCEACAM1-4Sを強発現するstable lineとCEACAM1 shRNA plasmidによりCEACAM1を発現抑制したstable lineについて、CD133、CD44、EpCAMの発現細胞数を定量的に評価し、がん幹細胞のCEACAM1 isoform balance変化によるがん幹細胞の分化誘導について検討する。さらに、flow cytometryにてCD133、CD44、またはEpCAMの陽性陰性細胞をsortし、CEACAM1-4LまたはCEACAM1-4S強発現株およびCEACAM1 knock downのcell lineについて3次元培養にて腺管形成について検討し、CEACAM1の発現およびisoform balanceによるがん幹細胞の腺管形成能との関連について検討する。さらにNOD/SCIDマウスの直腸orthotopic modelにおいて、腫瘍増殖および組織形成、浸潤についてin vivoで検討する。先述のCEACAM1遺伝子を導入、遺伝子抑制したstable cell linesを用いて、をflow cytometryでCD133、CD44、またはEpCAMの陽性細胞を分離し、大腸線維芽培養細胞CCO-18Co(American Type Culture Collection)を同時に直腸粘膜に移入し、3週間後に腫瘍を摘出し、組織形態と筋線維芽細胞の誘導について病理組織学的に評価する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
基礎的臨床的ににがん幹細胞のCEACAM1 isoform balance変化によるがん幹細胞の分化誘導について検討するため、免疫染色に用いるCEACAM1 monoclonal antibody (29H2, Abcam) (64,000円)、CD133 monoclonal antibody (293C3, Miltenyi Biotec) (41,000円)、CD44 monoclonal antibody (156-3C11, Cell Signaling Technology) (46,000円)、EpCAM(VU1D9, Cell Signaling Technology) (46,000円)、さらにTGF beta signaling pathwayの検討のためTBRI(v-22, Santa Cruz) (51,000円), SPTBN1(ab84498, Abcam) (64,000円), Smad3 (51-1500, Invitrogen) (63,000円)および試薬消耗品、Western blotting試薬、mRNAレベルで評価するために行うRT-PCR試薬、またCEACAM1-4Lおよび-4Sを定量的に検討するためのreal-time RT-PCR試薬を計上する。基礎的研究においては、大腸癌培養細胞HT29の培養試薬（培養液、培養器具）、3次元培養に用いるマトリゲル10 mL -20°C(37,400円)、を経費としてそれぞれ計上した。NOD/SCIDマウスの直腸orthotopic modelにおいて、腫瘍増殖および組織形成、浸潤についてin vivoで検討するために、NOD/SCID mouse (CB17-Prkdc<scid>/J, NOD-SCID,日本チャールズ・リバー、8300円/匹)を計上する。
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