2011 Fiscal Year Research-status Report
マトリックスプロテアーゼＨｔｒＡ１によるケロイド組織の浸潤メカニズム
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23592646
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
内藤 素子 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (30378723)
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| Project Period (FY) |
2011-04-28 – 2014-03-31
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| Keywords | ケロイド |
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| Research Abstract |
１）ケロイド組織２例と正常皮膚１例より、NP40含有蛋白抽出Buffer（1%NP40Tris-Cl buffer）を用いて、蛋白を抽出し、抗HtrA1、抗フィブロネクチン抗体、抗コラーゲンα2(I)抗体、抗コラーゲンα1(III)抗体を用いて、Western blotを行った。ケロイド組織のうち、正常皮膚と比較して、１例は、フィブロネクチン、コラーゲンI型、III型のfragmentationが高度に観察されたが、もう１例では、その差が顕著でなかった。症例数が少ないため、今後、症例数をもっと増やして、検討を行う必要があることと、蛋白抽出バッファーの検討を行う予定である。HtrA1の発現量は、２例とも、正常皮膚に比較して高度に発現していた。２）ケロイド組織１例と正常皮膚組織１例より、Explant法にて線維芽細胞を採取し、得られた細胞に対して、１）と同様の実験を行った。その結果、ケロイド由来線維芽細胞では、正常皮膚由来線維芽細胞と比較し、HtrA1の発現量が高く、フィブロネクチン、コラーゲンI型、III型のfragmentationが高度に観察された。３）ケロイド由来細胞において、HtrA１の発現をRNAi（Steath RNAi, Invitrogen）を用いてノックダウンする系の構築を行った。３種のStealth RNAiと１種のコントロールStealth RNAiを用いて、ケロイド細胞の他の遺伝子発現に損傷を与えることなく、HtrA1のノックダウンに成功した。ノックダウンの成否については、細胞よりRNAを抽出し、リアルタイムPCRにより、発現量を比較することにより確認した。ノックダウン後、７２時間でサンプリングを行った結果、フィブロネクチン、コラーゲンI型、III型のfragmentationの減少についてははっきりと確認できなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
H２３年度の実験予定としては、HtrA1の発現量と、フィブロネクチン、コラーゲンI型、III型のfragmentationの程度の比較を、ケロイド組織と正常皮膚組織間で、さらにはケロイド由来線維芽細胞と正常皮膚由来線維芽細胞間で実施することが大きな目標であったが、それについては実施し、ケロイド組織および、ケロイド由来線維芽細胞のいずれにおいても、HtrA1の高発現と、フィブロネクチン、コラーゲンI型、III型のfragmentationが高度に観察された。また、ケロイド由来細胞においてHtrA1の発現をノックダウンする系を構築し、それにおいて、フィブロネクチン、コラーゲンI型、III型のfragmentationの程度が変化するかを観察できた。以上の点は、本年度の計画をほぼ遂行したといえる。
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| Strategy for Future Research Activity |
H23年度では、ケロイド３例、正常皮膚２例しか採取できなかったため、検体数が不足している。ケロイド組織、正常皮膚組織、およびケロイド由来線維芽細胞と正常皮膚由来線維芽細胞の検体数をさらに増やすことが第一である。患者のリクルートにさらに力を入れ、検体の確保を推進することがなにより重要である。蛋白抽出の系については、bufferの変更等についても実験を行う。特に、正常皮膚検体は大きさが小さいものがほとんどで、そこから蛋白や細胞が少量しか採取できないため、検体数の確保に力をいれることが重要である。H23年度で確立した系において、N数を増やし、データの信頼性をあげることにつとめ、ノックダウンの系は、サンプリングの時期についても検討を加え、系を確立させる。それと同時に、H24年度は、HtrA1によるマトリックスのfragmentationにより、ケロイド由来細胞の移動性が増強されるかについての検討を進めて行く。Muaneyらの方法（Mauney J et al, Matrix Biol.2010, in press）を応用することにより、6穴プレートの内側に、メッシュインサートを挿入し、メッシュ内で細胞を培養、heat shockによる細胞刺激を与えた後、メッシュインサートを通り抜けた細胞数を数えることにより、移動性の増減を観察する。メッシュインサート内での細胞培養は、マトリックスコーテイングなしのものと、コラーゲン、フィブロネクチンをコーテイングしたものを用意する。マトリックスの存在により、移動性が増強するかを比較する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
研究費は、消耗品と旅費に使用する予定である。消耗品の内訳は以下のとおりである：検体組織処理、および細胞培養用細胞培養、細胞生物・生化学実験試薬購入費用として６０万円、蛋白抽出およびWestern blot関連試薬、抗体購入費用として２５万円、real time PCR用試薬として３０万円、組織学的実験費用として３０万円の計１４５万円を計画している。それ以外に、成果を学会で発表するために、国内旅費１０万円、外国旅費１２万円を計画している。
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