ＣＣＮファミリー間のネットワーク形成による筋肉内異所性骨化の分子機構の解明

2012 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 23592732
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 西田 崇 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 助教 (30322233)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 滝川 正春 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (20112063) ; 久保田 聡 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 准教授 (90221936) ; 服部 高子 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 助教 (00228488) ; 青山 絵理子 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 助教 (10432650)
• Keywords: 筋肉内異所性骨化 / マウス筋芽細胞 / CCN2 / CCNファミリー / 筋管形成 / 骨芽細胞様変化

Research Abstract

マウス筋芽細胞株C2C12細胞に炎症性シグナルとしてTNFαを作用させると、CCNファミリーの古典メンバーの中でCCN2のみがTNFαによって発現誘導されることを明らかにした。またCCN2がBMP2と結合し、その作用を修飾することが報告されており、これらのことから、我々はCCNファミリー分子群の中でCCN2が筋肉内異所性骨化に深く関与していると考えた。平成23年度ではC2C12細胞を用いて、CCN2の筋芽細胞に対する作用を明らかにした。これらの結果をもとに平成24年度では実際のマウスの筋組織から筋芽細胞を単離し、CCN2における作用を解析すると共にCCN2欠損マウス由来の筋芽細胞の細胞増殖や筋管細胞への分化に与える影響及び石灰化に対する影響を解析した。
(１) マウスの菲腹筋から単離した筋芽細胞にTNFα刺激を加えると、C2C12細胞と同様にCCN2の産生量の増加が見られた。(２) マウス筋芽細胞にCCN2を添加すると、筋管細胞のマーカーであるMyosin heavy chain (MHC)の遺伝子発現量が低下した。(３) CCN2欠損マウスから単離した筋芽細胞による筋管形成能は野生型マウス由来の細胞よりも亢進した。しかし、MyoDやMHCなどの筋管細胞のマーカー遺伝子の発現量は逆に低下した。(４) BMP2によるCCN2欠損マウス由来筋芽細胞のアルカリホスファターゼ(ALP)染色のレベルは野生型マウス由来筋芽細胞に比べて上昇した。(５) CCN2欠損マウス由来筋芽細胞において骨芽細胞のマーカー分子であるALP及びOsterixの遺伝子発現レベルは野生型マウス由来筋芽細胞に比べて上昇した。
これらの結果からCCN2は筋芽細胞において調和のとれた増殖及び分化に必要であるだけでなく、異所性骨化の抑制にも関わっていることが示唆された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

平成24年度の研究目的はC2C12細胞のような細胞株を用いたCCN2の作用を検討するのではなく、実際のマウスの筋組織から単離した筋芽細胞によるCCN2の作用を調べることであるから、この点に関しては順調に進展している。また、CCN2欠損マウスからも筋芽細胞を単離し、CCN2欠損マウス由来筋芽細胞による筋管形成やBMP2刺激による骨芽細胞様変化に対する影響を解析できた点は当初計画よりも進展しているのかもしれない。しかしながら、研究計画に含まれている動物実験に関しては遅れているため、総合的に判断して本課題は概ね順調に進展していると考えている。

Strategy for Future Research Activity

平成23年度はC2C12細胞におけるCCN2の作用を中心に行い、平成24年度はマウス筋芽細胞における解析を中心に行った。今後はこれらの結果をもとに動物実験を中心としたCCN2の異所性骨化における役割を解析していく必要があるが、この時点でこれまでの成果をまとめることも必要である。よって、今後はこれまでの成果をまとめつつ動物実験を行っていく予定である。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

当初計画では平成24年度に市販のマトリゲル内にBMP2、CCN2あるいはその両者を混合した後、マウス腹部皮下に注入し、異所性骨化がどのように進行していくかという動物実験を計画していた。この実験はマウス下腿に人為的に異所性骨化を引き起こさせる動物実験の前段階としての位置付けの動物実験と当初考えていたが、in vitroの筋芽細胞におけるCCN2の作用が明らかとなった時点で、この動物実験を行っても、CCN2の筋肉内異所性骨化における役割を解明するのに十分な成果が得られないと考えた。そのため、当初計画を変更したことで当該研究費が生じたが、平成25年度には実際の筋肉内に異所性骨化を引き起こさせる実験に着手する予定であるため、平成25年度に請求する研究費と当該研究費を合わせて研究計画を実施する予定である。

Research Products

• [Journal Article] Novel chondrogenic and chondroprotective effects of the natural compound harmine. (2013)
  • Author(s): Hara, E. S., Ono, M., Kubota, S., Sonoyama, W., Oida, Y., Hattori, T., Nishida, T., Furumatsu, T., Ozaki, T., Takigawa, M. and Kuboki, T
  • Journal Title: Biochimie Volume: 95 Pages: 347-381
  • DOI: 10.1016/j.biochi.2012.10.016. Epub 2012 Oct 29.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Anti-fibrotic effect of CCN3 accompanied by altered gene expression profile of the CCN family. (2013)
  • Author(s): Abd El Kader, T., Kubota, S., Janune, D., Nishida, T., Hattori, T., Aoyama, E., Perbal, B., Kuboki, T. and Takigawa, M.
  • Journal Title: J. Cell Commun. Signal. Volume: 7 Pages: 11-18
  • DOI: 10.1007/s12079-012-0180-4. Epub 2012 Oct 14.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Impaired glycolytic metabolism causes chondrocyte hypertrophy-like changes via promotion of phospho-Smad1/5/8 translocation into nucleus. (2013)
  • Author(s): Nishida, T., Kubota, S., Aoyama, E. and Takigawa, M.
  • Journal Title: Osteoarthritis Cartilage, Volume: 21 Pages: 770-709
  • DOI: 10.1016/j.joca.2013.01.013. Epub 2013 Feb 4.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Novel role of miR-181a in cartilage metabolism. (2013)
  • Author(s): Sumiyoshi K, Kubota S, Ohgawara T, Kawata K, Abd El Kader T, Nishida T, Ikeda N, Shimo T, Yamashiro T, Takigawa M
  • Journal Title: J Cell Biochem Volume: in press Pages: in press
  • DOI: 10.1002/jcb.24556.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Roles of heterotypic CCN2/CTGF-CCN3/NOV and homotypic CCN2-CCN2interactions in expression of the differentiated phenotype of chondrocytes. (2012)
  • Author(s): Hoshijima M, Hattori T, Aoyama E, Nishida T, Yamashiro T, Takigawa M.
  • Journal Title: FEBS J Volume: 279 Pages: 3584-3597
  • DOI: 10.1111/j.1742-4658.2012.08717.x. Epub 2012 Aug 28.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Role of low-density lipoprotein receptor related protein 1 (LRP1) in CCN2/connective tissue growth factor (CTGF) protein transport in chondrocytes. (2012)
  • Author(s): Kawata., K., Kubota, S., Eguchi, T., Aoyama, E., Moritani, N., Kondo, S., Nishida, T., Takigawa, M.
  • Journal Title: J Cell Sci Volume: 15 Pages: 2965-2972
  • DOI: 10.1242/jcs.101956.
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 軟骨細胞におけるCCN2発現の低出力超音波(LIPUS)による誘導。 (2013)
  • Author(s): 西田 崇、久保田聡、青山絵理子、山中信康、滝川正春
  • Organizer: 第12回日本再生医療学会総会
  • Place of Presentation: 横浜
  • Year and Date: 20130321-20130323
• [Presentation] 軟骨細胞におけるCCN2発現の低出力超音波(LIPUS)による誘導。 (2013)
  • Author(s): 西田 崇、久保田聡、青山絵理子、山中信康、滝川正春
  • Organizer: 第26回日本軟骨代謝学会
  • Place of Presentation: 大阪
  • Year and Date: 20130301-20130302
• [Presentation] Cartilage regenerative effects of CCN2 independent modules. (2013)
  • Author(s): Abd El Kdaer, T., Kubota, S., Nishida, T., Hattori, T., Aoyama, E., Janune, D., Kuboki, T., Takigawa, M.
  • Organizer: 第26回日本軟骨代謝学会
  • Place of Presentation: 大阪
  • Year and Date: 20130301-20130302
• [Presentation] Rab14 GTPaseのCCN2/CTGF結合因子としての同定と、これらの相互作用が軟骨細胞の小胞輸送に及ぼす役割。 (2013)
  • Author(s): 星島光博、服部高子、青山絵理子、西田 崇、山城 隆、滝川正春
  • Organizer: 第26回日本軟骨代謝学会
  • Place of Presentation: 大阪
  • Year and Date: 20130301-20130302
• [Presentation] 軟骨細胞のエネルギー代謝を支えるCCN2/CTGF。 (2013)
  • Author(s): 前田 彩、久保田聡、三宅由晃、河田かずみ、西田 崇、服部高子、森谷徳文、川木晴美、Karen M Lyons、飯田征二、滝川正春
  • Organizer: 第26回日本軟骨代謝学会
  • Place of Presentation: 大阪
  • Year and Date: 20130301-20130302
• [Presentation] Roles of the heterotypic CCN2-CCN3 and homotypic CCN2-CCN2 interactions in matrix synthesis in chondrocytes. (2012)
  • Author(s): Hoshijima, M., Hattori, T., Aoyama, E., Nishida, T., Yamashiro, T., Takigawa, M.
  • Organizer: 2012 The American Society for Cell Biology Annual Meeting
  • Place of Presentation: San Francisco, California, USA
  • Year and Date: 20121215-20121219
• [Presentation] Roles of CCN2 in energy metabolism in chondrocytes. (2012)
  • Author(s): Maeda, A., Kubota, S., Miyake, Y., Kawata, K., Nishida, T., Hattori, T., Moritani, N., Kawaki, H., Lyons, K.M., Iida, S., Takigawa, M.
  • Organizer: 2012 The American Society for Cell Biology Annual Meeting
  • Place of Presentation: San Francisco, California, USA
  • Year and Date: 20121215-20121219
• [Presentation] CCN2とOPGの分子間相互作用による新たな破骨細胞分化制御機構。 (2012)
  • Author(s): 青山絵理子、久保田聡、西田 崇、滝川正春
  • Organizer: 第85回日本生化学会大会
  • Place of Presentation: 福岡
  • Year and Date: 20121214-20121216
• [Presentation] 軟骨細胞のエネルギー代謝におけるCCN2/CTGFの役割。 (2012)
  • Author(s): 前田 彩、久保田聡、三宅由晃、河田かずみ、西田 崇、服部高子、森谷徳文、川木晴美、Karen M Lyons、飯田征二、滝川正春
  • Organizer: 第35回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 福岡
  • Year and Date: 20121211-20121214
• [Presentation] 軟骨細胞の代謝システムにおけるCCN2の役割。 (2012)
  • Author(s): 前田 彩、久保田聡、三宅由晃、河田かずみ、服部高子、西田 崇、森谷徳文、川木晴美、Karen M Lyons、飯田征二、滝川正春
  • Organizer: 第33回岡山歯学会学術集会
  • Place of Presentation: 岡山
  • Year and Date: 20121125-20121125
• [Presentation] 乳酸共存下での細胞内ATP量の減少は軟骨細胞の肥大化を引き起こす。 (2012)
  • Author(s): 西田 崇、久保田聡、青山絵理子、滝川正春
  • Organizer: 第54回歯科基礎医学会
  • Place of Presentation: 郡山
  • Year and Date: 20120914-20120916
• [Presentation] CCN2/CTGF欠損が軟骨細胞のエネルギー代謝に及ぼす影響。 (2012)
  • Author(s): 前田 彩、久保田聡、服部高子、西田 崇、飯田征二、滝川正春
  • Organizer: 第54回歯科基礎医学会
  • Place of Presentation: 郡山
  • Year and Date: 20120914-20120916
• [Presentation] CCN2-OPG間相互作用による破骨細胞形成新規制御機構の解明。 (2012)
  • Author(s): 青山絵理子、久保田聡、西田 崇、滝川正春
  • Organizer: 第54回歯科基礎医学会
  • Place of Presentation: 郡山
  • Year and Date: 20120914-20120916
• [Presentation] Effect of CCN2 on FGF2-induced proliferation of and MMP-9 and -13 productions by chondrocytes. (2012)
  • Author(s): Nishida, T., Kubota, S., Aoyama, E., Janune, D., Maeda, A., Takigawa, M.
  • Organizer: 22nd IUBMB-37th FEBS Congress
  • Place of Presentation: Sevilla, Spain
  • Year and Date: 20120904-20120909
• [Presentation] Effect of CCN2 independent modules on chondrogenic and osteoblastic cells. (2012)
  • Author(s): Abd El Kdaer, T., Kubota, S., Nishida, T., Hattori, T., Aoyama, E., Janune, D., Kuboki, T., Takigawa, M.
  • Organizer: 第30回日本骨代謝学会
  • Place of Presentation: 東京
  • Year and Date: 20120719-20120721
• [Presentation] 乳酸共存下での細胞内ATP量の減少は軟骨細胞の肥大化を引き起こす。 (2012)
  • Author(s): 西田 崇、久保田聡、高嶋壮一朗、滝川正春
  • Organizer: 第30回日本骨代謝学会
  • Place of Presentation: 東京
  • Year and Date: 20120719-20120721
• [Presentation] CCN2 modules; Independent and combinational effect on chondrocytic cells. (2012)
  • Author(s): Abd El Kdaer, T., Kubota, S., Nishida, T., Hattori, T., Aoyama, E., Janune, D., Kuboki, T., Takigawa, M.
  • Organizer: 第3回骨バイオサイエンス研究会
  • Place of Presentation: 岡山
  • Year and Date: 20120714-20120714
• [Presentation] The CCN2-inducer Harmine promotes chondrogenesis and protection against TNFα-induced inflammation. (2012)
  • Author(s): Hara, E., Ono, M., Kubota, S., Sonoyama, W., Oida, Y., Hattori, T., Nishida, T., Furumatsu, T., Ozaki, T., Takigawa, M., Kuboki, T
  • Organizer: 90th General Session & Exhibition of the IADR
  • Place of Presentation: Iguacu falls, Brazil
  • Year and Date: 20120620-20120623
• [Presentation] Effect of CCN2 independent modules on chondrocytic cells. (2012)
  • Author(s): Abd El Kader, T., Kubota, S., Nishida, T., Hattori, T., Aoyama, E., Janune, D., Kuboki, T., Takigawa, M.
  • Organizer: 90th General Session & Exhibition of the IADR
  • Place of Presentation: Iguacu falls, Brazil
  • Year and Date: 20120620-20120623
• [Remarks] 岡山大学歯学部口腔生化学分野
  • URL: www.dent.okayama-u.ac.jp/seika/