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2012 Fiscal Year Annual Research Report

プロテインキナーゼCの生体内での基質の網羅的探索

Research Project

Project/Area Number 23650214
Research InstitutionThe University of Tokyo

Principal Investigator

饗場 篤  東京大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (20271116)

Keywords脳分子プロファイリング
Research Abstract

本研究では、マウス脳のリン酸化プロテオミクスによってプロテインキナーゼC(PKC)gammaの基質を同定し、小脳機能におけるPKCシグナルの重要性を明らかにすることを試みた。昨年度までにPKCgammaノックアウトマウス(KO)の作製と小脳におけるリン酸化ペプチドの相対定量を行った。その結果、PKCgamma KOにおいて特にリン酸化の低下が顕著であった117種類のタンパク質を同定することができた。本年度はこれらの基質候補タンパク質の機能を解析するために下記の実験を行った。
(1)リン酸化候補タンパク質の発現解析
PKCgamma KOにおいてリン酸化量が大きく低下していた3つのタンパク質(Protein NDRG4, diacylglycerol kinase zeta, Serine/Threonine kinase Tao1)について、mRNAの発現解析を行った。マウス小脳よりtotal RNAを調製し、oligo-dTプライマーによって逆転写を行った。次に、それぞれの遺伝子についてリアルタイムPCRによって、mRNAの発現量を比較した。その結果、それぞれの遺伝子の発現量に野生型とKOとの間に大きな変化は見られなかった。このことからPKCgamma KOにおけるリン酸化量の低下は遺伝子発現量の変化によるものではないことを確認することができた。
(2)リン酸化ペプチドに対する抗体の作製
上記三種類のタンパク質についてリン酸化抗体の作製を行った。それぞれのタンパク質に対して、MS/MSによって同定されたアミノ酸残基がリン酸化されたペプチドを合成し、ウサギに接種した。ELISAによって抗体価の上昇したウサギより全採血を行い、抗血清を得た。現在これらの抗血清を用いて、ウエスタンブロットによるリン酸化量の変動解析と、免疫染色によるプルキンエ細胞における局在解析を行っている。

  • Research Products

    (5 results)

All 2013 2012 Other

All Journal Article (3 results) (of which Peer Reviewed: 3 results) Presentation (1 results) Remarks (1 results)

  • [Journal Article] Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 (RAC1) regulates glucose-stimulated insulin secretion via modulation of F-actin2013

    • Author(s)
      Asahara S, Shibutani Y, Teruyama K, InoueHY, Kawada Y, Etoh H, Matsuda T,Kimura-Koyanagi M, Hashimoto N, Sakahara M, Fujimoto W, Takahashi H, Ueda S, Hosooka T, Satoh T, Inoue H, Matsumoto M, Aiba A, Kasuga M, Kido Y
    • Journal Title

      Diabetologia

    • DOI

      DOI:10.1007/s00125-013-2849-5

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Guidepost neurons for the lateral olfactory tract: Expression of metabotropic glutamate receptor 1 and innervation by glutamatergic olfactory bulb axons2012

    • Author(s)
      Hirata T, Kumada T, Kawasaki T, Furukawa T, Aiba A, Conquet F, Saga Y, Fukuda A
    • Journal Title

      Developmental Neurobiology

      Volume: 72 Pages: 1559-1576

    • DOI

      DOI:10.1002/dneu.22030

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Functional coupling of the metabotropic glutamate receptor, InsP3 receptor and L-type Ca2+ channel in mouse CA1 pyramidal cells2012

    • Author(s)
      Kato HK
    • Journal Title

      Journal of Physiology

      Volume: 590 Pages: 3019-3034

    • DOI

      10.1113/jphysiol.2012.232942

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] 中枢神経系において恒常的活性化型mTORを発現するマウスの作製と解析2012

    • Author(s)
      饗場 篤
    • Organizer
      日本分子生物学会
    • Place of Presentation
      福岡国際会議場(福岡県)
    • Year and Date
      20121211-20121214
  • [Remarks] 東京大学大学院医学系研究科疾患生命工学センター動物資源学部門ホームページ

    • URL

      http://lar.cdbim.m.u-tokyo.ac.jp/index.html

URL: 

Published: 2014-07-24  

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