2011 Fiscal Year Research-status Report
停止複製フォーク結合タンパク質による細胞内での複製フォークの安定化の試み
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23657081
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research |
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Principal Investigator |
正井 久雄 (財)東京都医学総合研究所, ゲノム医科学研究分野, 参事研究員 (40229349)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田中 卓 (財)東京都医学総合研究所, ゲノム医科学研究分野, 主任研究員 (80425686)
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| Project Period (FY) |
2011-04-28 – 2013-03-31
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| Keywords | DNA複製停止 / 複製フォーク / DNA結合タンパク質 / ゲノム不安定性 / 染色体不安定性症候群 / PriAタンパク質 / 複製ストレス / チェックポイント応答 |
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| Research Abstract |
細胞内で停止したDNA複製フォークの安定化を促進する新規技術を開発するために、まず、停止フォークを特異的に検出する方法を確立する必要がある。大腸菌PriAタンパク質は、DEXH型のヘリカーゼであり、生化学的に停止フォーク構造を特異的に認識して結合する能力を有することに加え、遺伝学的に複製再開始反応で重要な役割を果たすことが明らかにされている。このタンパク質は、細胞内でも停止したフォークに特異的に結合している可能性が示唆される数少ない因子の１つであり、この結合を検出することで、生体内でのフォーク停止の認識およびその安定化の分子基盤確立に大きく寄与することが期待できる。特異的検出方法確立のために、染色体免疫沈降法（chromatin immunoprecipitation, ChIP）とマイクロアレイ（chip）を組み合わせたChIP-on-chipによる解析を試みたところ、チミン枯渇処理によりフォークを止める処理をした細胞では、複製起点付近に大きなピークのクラスターを見出した。この事は、PriAが細胞内で停止したフォーク構造に実際に結合し、チミン枯渇は複製起点付近に停止フォークを蓄積させる可能性を示唆する。PriAの細胞内での集積を確認するため、免疫染色によってPriAのスポットを調べた結果、チミン枯渇処理をした細胞においては、核様体内に特異的スポットを示唆する信号が検出され、枯渇から解放すると、これが拡散することを確認した。以上の結果は、PriAタンパク質を特異的に追跡することにより、ゲノム上でフォークが停止しやすい領域（染色体脆弱部位）を検出したり、PriAにより停止フォークを安定化できるかどうかを視覚化するための有用なツールとして利用できる可能性を強く示唆する。現在上記で開発した技術を真核細胞における停止複製フォークの検出安定化に応用するための実験を行なっている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
進行中の複製が様々な原因で停止することは知られているものの、実際の生きた細胞内でフォーク停止を検出する技術はまだ確立されていない。大腸菌においても、PriAタンパク質が停止フォークを認識することは試験管内で以前から示されてきたが、細胞内で直接示した報告はない。今回、PriAタンパク質が生細胞内の停止フォークに結合している可能性を示唆したことは、PriAのフォーク安定化因子としての機能の確定に重要な寄与をするのみでなく、真核細胞を含めた実際の細胞内での停止フォーク安定化と不安定化回避に関わる反応を直接観察できる可能性を示すものであり、本分子機構の確立に向けた大きな前進と考えている。しかし、複製フォーク認識因子の酵母、動物細胞での発現の確認がおくれており、今年度早急に進める予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
実際に特異的な領域で複製フォークが停止するような変異体、あるいは、PriAの機能を限定する変異体で、PriAのゲノム上での特異的結合を確認し、大腸菌細胞内停止フォーク検出技術を確立する。この技術を基盤として、分裂酵母及び動物細胞でPriAおよびRecGタンパク質を発現し、薬剤等でフォーク不安定化を誘導したときに、これを回避・安定化できるかどうかを解析する。又、PriAならびにRecGの欠失変異体解析により、最小機能ドメインを同定し、これを動物細胞内で発現させたときに、停止フォーク不安定化回避に機能するかどうかを確認する。これらの解析により、同定された最小ドメインが、実際のフォーク不安定性症候群由来の細胞でも機能することを確認することを目指す。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
培養実験用の培地、血清、および染色体免疫沈降法に使用する一次抗体、二次抗体、加えて沈降してきたDNAを増幅する酵素等主に消耗品に使用する。また、フォーク停止を起こしやすい領域の網羅的検出は、マイクロアレイによるしか方法がないので、このchip購入費用を計上する。研究成果発表のための旅費等の費用も、妥当な額を計上した。
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