2012 Fiscal Year Annual Research Report
ＤＮＡメチル化解析による培養間葉系幹細胞のミニマム・リプログラミング技術の開発
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23659938
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
星 和人 東京大学, 医学部附属病院, 准教授 (30344451)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
高戸 毅 東京大学, 医学部附属病院, 教授 (90171454)
森 良之 東京大学, 医学部附属病院, 准教授 (70251296)
藤原 夕子 東京大学, 医学(系)研究科(研究院), 特任助教 (50466744)
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| Keywords | 骨再生医療 / ＭＳＣ / メチル化 / リプログラミング |
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| Research Abstract |
培養に伴う細胞劣化によるDNA メチル化変動部位の同定をおこなった。MSCはSDラット4週齢オスの両側大腿骨及び脛骨より単離し、ノンコートディッシュに播種、増殖培地（DMEM＋10%ＦＢＳ＋1ng/mL bFGF）にて培養した。ラット4匹より回収した細胞を1ロットとし、これを6回繰り返した。P0およびP2でDNAの回収（Qiagen DNeasy Blood& Tissue kit）を行った。ＤＮＡについては、メチレーションアレイ（Nimblegen）にて15061のプロモーター領域について網羅的メチル化解析を行った。サンプルの解析にあたり、Roche納品データにてメチル化ピーク値を検出した領域のうち転写開始点より300ｂｐ以内の遺伝子77個を絞り込み、さらにP2/P0のピーク値の比が4/6ロット以上で低下しているないし3/6ロット以上で増加している22遺伝子を絞り込んだ。このうち、MSCにおいて継代により発現傾向に変化がある遺伝子をPCRにて同定した。実際の骨・軟骨分化誘導効率については、ペレットを作製し、1本あたり22万細胞を15ｍＬコニカルチューブに遠心した。ペレットの培養にあったっては、軟骨分化誘導培地を1.5mL添加し、1回培地を半量交換したのち1週間培養後にサンプルを回収し、IsogenにてRNAを回収した。リアルタイムPCR（Sybergreen）にて遺伝子発現を定量評価し、軟骨分化マーカーであるaggrecanやcol2および軟骨初期分化マーカーsox9の発現がＰ0よりもＰ２で低下するロットを認め、継代数が進むにつれて分化誘導に抵抗性を示すことが確認され、細胞劣化が検証された。
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