2012 Fiscal Year Annual Research Report
新規高精度赤外分光光度計の開発とそれを用いた巨大膜蛋白質のプロトンポンプ反応追跡
| Project/Area Number |
23685040
|
|---|
| Research Institution | The Institute of Physical and Chemical Research |
|---|
Principal Investigator |
久保 稔 独立行政法人理化学研究所, 城生体金属科学研究室, 研究員 (90392878)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2011-04-01 – 2014-03-31
|
| Keywords | 時間分解赤外分光 / プロトンポンプ / 酵素反応 / チトクロム酸化酵素 / 膜タンパク質 / フェムト秒レーザー |
|---|
| Research Abstract |
本研究の最終目標は、フロー・フラッシュ法による時間分解赤外分光装置を完成させ、ウシ心筋チトクロム酸化酵素（CcO）のO2還元／プロトンポンプ反応を追跡することである。すなわち、CO結合型CcOをフローし、O2と混合後、観測領域でCOを光解離することで、O2還元／プロトンポンプ反応を開始させる（COは光解離性の阻害剤）。COの光解離は、532 nmのナノ秒パルス光（ポンプ光）の照射により誘起する。平成24年度は、フロー試料に基質O2を混合するためのシステムの開発を行なった。一般的な手法である2液混合法は、本研究で扱う2液（高濃度のCO結合型CcOとO2飽和緩衝液）の粘性が大きく異なるために失敗した。そこで別の手法として、シリンジからセルに至る流路（PEEKチューブ）の途中に、O2透過性に優れたシリコンチューブ（5 cm程度）を挿入し、O2ガスがフローするガラス管内部にそのシリコンチューブを通すことで、O2を供給した。このシステムにより、0.5 mM以上のO2を混合することが可能となった。なお、O2濃度はRu(bpy)3の蛍光消光により評価した。このシステムを用いて、CO結合型CcO（0.3 mM）とO2を混合し、観測領域にて可視吸収スペクトルを測定したところ、常温では、CcOが観測領域に流れ込む前に（すなわちポンプ光照射前に）、COが熱的に解離して、O2との反応が開始してしまうことが判明した。COの熱的解離を防ぐためには、低温（4oC以下）で測定する必要がある。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
O2の混合には成功したが、CO（光解離性阻害剤）の熱的解離が問題となっており、反応を制御できていないため。
|
| Strategy for Future Research Activity |
本年度の実験では、温度を下げることにより、COの解離速度を低下させる。具体的には、フローの流路（シリンジ、チューブ、セル）を水ジャケットで覆い、4oC以下に温度をコントロールした上で実験を行なう。またケージドO2を用いた実験手法も並行して開発する。ケージドO2は、310～360 nmの紫外光照射によりO2を発生する化合物である。ケージドO2を用いる場合、観測領域に流れ込む前にCcOとO2が反応を開始することはない。現在、ケージドO2を開発・改良中である。
|
-
[Journal Article] Site-specific protein dynamics in communication pathway from sensor to signaling domain of oxygen sensor protein, HemAT-Bs: Time-resolved ultraviolet resonance Raman study.2012
Author(s)
El-Mashtoly, S. F., Kubo, M., Gu, Y., Sawai, H., Nakashima, S., Ogura, T., Aono, S., Kitagawa, T.
-
Journal Title
J. Biol. Chem.
Volume: 287
Pages: 19973-19984
DOI
Peer Reviewed
-
-
[Journal Article] Chromium(IV)-peroxo complex formation and its nitric oxide dioxygenase reactivity.2012
Author(s)
Yokoyama, A., Han, J. E., Cho, J., Kubo, M., Ogura, T., Siegler, M. A., Karlin, K. D., Nam, W.
-
Journal Title
J. Am. Chem. Soc.
Volume: 134
Pages: 15269-15272
DOI
Peer Reviewed
-
[Journal Article] Copper(I)-dioxygen reactivity in a sterically demanding tripodal tetradentate tren ligand. Formation and reactivity of a mononuclear copper(II) end-on superoxo complex.2012
Author(s)
Kobayashi, Y., Okubo, K., Nomura, T., Kubo, M., Fujieda, N., Sugimoto, H., Fukuzumi, S., Goto, K., Ogura, T., Itoh, S.
-
Journal Title
Eur. J. Inorg. Chem.
Volume: 29
Pages: 4574-4578
DOI
Peer Reviewed
-
