• Search Research Projects
  • Search Researchers
  • How to Use
  1. Back to project page

2011 Fiscal Year Research-status Report

独自のin vivo部位特異的遺伝子導入法による、コンディショナル発現系の開発

Research Project

Project/Area Number 23700514
Research InstitutionTokai University

Principal Investigator

大塚 正人  東海大学, 医学部, 講師 (90372945)

Project Period (FY) 2011-04-28 – 2013-03-31
Keywordsトランスジェニックマウス / 部位特異的遺伝子挿入 / Cre-loxP / 顕微注入
Research Abstract

当該年度は、以下の3点に関して進めた。1)遺伝子導入効率の改善:これまでDNAで供給していたCre組換え酵素をmRNAで供給することにより、より効率良く目的遺伝子をゲノムに挿入できる(従来の効率である4-5%以上)可能性がある。そこで今回、Cre mRNA(コドン最適化されたiCreを使用)を合成し、既に動くことが分かっているドナーベクターと共に受精卵に顕微注入した。その結果、11-45ng/ulの濃度のmRNAを注入した場合は胚が全く得られず、5ng/ulで顕微注入した時のみ、わずか2個体の胚を回収することができた。そのうち1個体(50%)が目的の組換え体であることが分かった。mRNAを用いることにより効率改善が期待される結果が得られたものの、胚の致死率が予想以上に高かった。2)時期・組織特異的な遺伝子発現系の確立:哺乳類Kox1遺伝子のKRABリプレッサードメインを用いたドキシサイクリンによる遺伝子発現誘導系の確立を目指した。まず、そのための発現コンストラクトを作製し、細胞レベルで検証を行うために、piggyBacトランスポゾンシステムを利用してES細胞へ導入した。得られたクローンの解析を行った結果、1ug/mlのドキシサイクリンで目的遺伝子発現が誘導できること、及び遺伝子ノックダウンにも応用可能であることが分かった。なお、組織特異的プロモーターを用いた遺伝子発現系のPITT法への応用も進めつつある(新たに作製したコンストラクトを用い、現在Tgマウスを作製中である)。3)Dre-rox系による、コンディショナル発現系の開発:Dre組換え酵素依存的に緑(eGFP)から赤(tdTomato)に蛍光が変わるDreレポーターマウスをPITT法で作製した。そこから得た受精卵の2細胞期受精卵の片方の細胞核にDre発現ベクターを顕微注入し、赤緑蛍光モザイク個体になることを確認した。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

当初の計画より進行がやや遅れている理由は以下の2つによる。1)コンストラクト作製に時間を費やしたこと、及び2)顕微注入は学内の研究支援センターを利用して行っているが、2011年度中後半は予想に反して他の利用者のマウス作製依頼が集中してしまったため、顕微注入予定を遅らせざるを得なかったこと、による。特にTg作製法自体の技術的な理由ではないため、次年度は本研究計画を継続し結果を出していく予定である。

Strategy for Future Research Activity

前年度に、学内の研究支援センターを利用して行う予定の顕微注入について、他の利用者のマウス作製依頼が集中して予定が遅れてしまったので、2012年度に行うこととする。それを含め、以下の3点について研究を進める予定である。1)Cre mRNA導入による遺伝子導入効率の改善:当該年度の実験では、Cre mRNA濃度が適切でなかったためか胚の致死率が予想以上に高かったため、mRNAの至適濃度を検討していきたい。それにより、10%以上(CreをDNAとして注入していた場合の2倍以上)の挿入効率を達成できるようにしたい。2)コンディショナルアリル(floxedアリル)の挿入:当初は、loxP配列をメチル化して挿入時のfloxedカセットの欠失を抑制することによって、floxedアリル挿入を計画していたが、最近の報告から別の酵素(PhiC31インテグラーゼ)を用いて部位特異的遺伝子挿入が可能であると分かったため、よりシンプルなPhiC31の系を我々のシステムに付加することとする。その為に、変異loxP配列の他にattP配列も有する種マウス(目印がゲノムに挿入されたマウス)を新たに作製してfloxedアリルの挿入法を確立する。新たな種マウスは既にキメラマウスまで作製されており、今後、その実用性を検討していく。3)時期・組織特異的な遺伝子発現系の確立:Nephrin、及びThy1プロモーターを用いてeGFP、あるいはDre酵素を発現するTgマウスをPITT法で作製し、その組織特異的遺伝子発現パターンを検証する。Dre発現マウスに関しては、Dreレポーターマウスと交配して得られたダブルTgマウスを用いる。また、ドキシサイクリンによる遺伝子発現誘導型コンストラクトのTgマウスも作製して、in vivoでの発現誘導能を検証する。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

「次年度使用額」分については、進行が遅れていたTgマウス(組織特異的プロモーターを用いたもの)の作製に使用する。また解析を効率よく進め、研究が遅れている分を補うために、実験補助員を雇用する予定である。2012年度の直接経費を用い、コンストラクトを作製する際に大腸菌の培養を行うために必要なインキュベーターを購入する。また、マウスへの顕微注入、コンストラクトの塩基配列の確認等については、学内の研究支援センターを利用して行うため、それらに要する費用に研究費を用いる。また、その解析には実験補助員に手伝ってもらうが、「次年度使用額」で不足する謝金分を2012年度の直接経費から補う。得られた成果は、国内外の学会で発表すると同時に英文原著論文として投稿する予定であり、それらに要する費用として研究費を用いる。

  • Research Products

    (16 results)

All 2012 2011

All Journal Article (5 results) (of which Peer Reviewed: 3 results) Presentation (10 results) Book (1 results)

  • [Journal Article] Targeted transgenesis through pronuclear injection of improved vectors into in vitro fertilized eggs2012

    • Author(s)
      Ohtsuka M., Miura H., Nakaoka H. Kimura M., Sato M. and Inoko H.
    • Journal Title

      Transgenic Res.

      Volume: 21 Pages: 225-226

    • DOI

      10.1007/s11248-011-9505-y

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Production of miRNA-based knockdown mice showing reproducible knockdown of the gene of interest2012

    • Author(s)
      Miura H., Inoko H., Kimura M. and Ohtsuka M.
    • Journal Title

      J. Reprod. Develop.

      Volume: 58 Pages: A9

  • [Journal Article] Loss of glial fibrillary acidic protein marginally accelerates disease progression in a SOD1H46R transgenic mouse model of ALS2011

    • Author(s)
      Yoshii Y., Otomo A., Pan L., Ohtsuka M. and Hadano S.
    • Journal Title

      Neurosci. Res.

      Volume: 70 Pages: 321-329

    • DOI

      10.1016/j.neures.2011.03.006.

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Simple cloning strategy using GFPuv gene as positive/negative indicator2011

    • Author(s)
      Miura H., Inoko H., Inoue I., Tanaka M., Sato M. and Ohtsuka M.
    • Journal Title

      Anal. Biochem.

      Volume: 416 Pages: 237-239

    • DOI

      10.1016/j.ab.2011.04.040.

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] PITT法――マウス受精卵での部位特異的遺伝子導入法2011

    • Author(s)
      大塚正人
    • Journal Title

      実験医学

      Volume: 29 Pages: 2687-2692

  • [Presentation] Pronuclear Injection-Based Mouse Targeted Transgenesis by Site-Specific Recombination2011

    • Author(s)
      Masato Ohtsuka
    • Organizer
      10th Transgenic Technology Meeting(招待講演)
    • Place of Presentation
      TradeWinds Island Grand Resort, USA
    • Year and Date
      24-26 October 2011
  • [Presentation] 赤色蛍光強発現Tgマウスの歯科領域研究における有用性2011

    • Author(s)
      桑島幸紀、古川真司、安藤禎紀、佐原資謹、石崎明、大塚正人、藤村朗、清野幸男、三浦廣行
    • Organizer
      第53回歯科基礎医学会学術大会・総会
    • Place of Presentation
      長良川国際会議場
    • Year and Date
      2011年9月30日~10月2日
  • [Presentation] SOD1H46R遺伝子トランスジェニックALSマウスモデルにおいてグリア線維性酸性蛋白の欠損は疾患をわずかに進行させる2011

    • Author(s)
      秦野伸二、吉井康裕、大友麻子、潘雷、大塚正人、岩崎泰雄
    • Organizer
      第54回日本神経化学会大会
    • Place of Presentation
      石川県山代温泉 瑠璃光
    • Year and Date
      2011年9月26~28日
  • [Presentation] 再現性良いノックダウン効率を示す、miRNA 発現トランスジェニックマウス作製法の確立2011

    • Author(s)
      三浦浩美、猪子英俊、木村穣、大塚正人
    • Organizer
      第104回日本繁殖生物学会大会
    • Place of Presentation
      いわて県民情報交流センター・アイーナ
    • Year and Date
      2011年9月15~17日
  • [Presentation] 受精卵への顕微注入法を介した、部位特異的トランスジェニックマウス作製法2011

    • Author(s)
      大塚正人、三浦浩美、木村穣、猪子英俊
    • Organizer
      第58回日本実験動物学会総会
    • Place of Presentation
      タワーホール船堀
    • Year and Date
      2011年5月25~27日
  • [Presentation] SOD1H46R遺伝子組み換えALSマウスモデルにおいてグリア線維性産生蛋白の欠損は疾患をわずかに進行させる2011

    • Author(s)
      吉井康裕、大友麻子、Pan L.、大塚正人、川邊清一、池田憲、岩崎泰雄、池田穣衛、秦野伸二
    • Organizer
      第52回日本神経学会学術大会
    • Place of Presentation
      名古屋国際会議場
    • Year and Date
      2011年5月18~20日
  • [Presentation] 遺伝子トランスジェニックALSマウスモデルにおいてグリア線維性酸性蛋白の欠損は疾患進行に若干の影響を与える2011

    • Author(s)
      吉井康裕、大友麻子、潘雷、大塚正人、岩崎泰雄、秦野伸二
    • Organizer
      第34回日本分子生物学会年会
    • Place of Presentation
      パシフィコ横浜
    • Year and Date
      2011年12月13~16日
  • [Presentation] GFPuv遺伝子とTypeIIS制限酵素を用いた遺伝子発現ベクターの簡便な構築法とその応用2011

    • Author(s)
      三浦浩美、佐藤正宏、猪子英俊、大塚正人
    • Organizer
      第34回日本分子生物学会年会
    • Place of Presentation
      パシフィコ横浜
    • Year and Date
      2011年12月13~16日
  • [Presentation] 選択用薬剤を使わない簡便な遺伝子高発現細胞株の取得方法2011

    • Author(s)
      佐藤正宏、大塚正人、中村伸吾、櫻井敬之、渡部聡
    • Organizer
      第34回日本分子生物学会年会
    • Place of Presentation
      パシフィコ横浜
    • Year and Date
      2011年12月13~16日
  • [Presentation] Vibratory Microinjection System Facilitates Injection of BAC Transgene2011

    • Author(s)
      Dilidaer Kudereti, Fujio Miyawaki, Hiroki Haremaki, Tomohiro Yoshizawa, Masato Ohtsuka, Jun Hasegawa
    • Organizer
      Mouse Molecular Genetics
    • Place of Presentation
      Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge, UK.
    • Year and Date
      20 - 23 September 2011
  • [Book] a medaka mutant exhibiting a mirror-image pattern duplication of the dorsal-ventral axis. in Medaka: Model for Organogesis, Human Diseases and Evolution2011

    • Author(s)
      Ohtsuka M., Takeda H., and Shimada A.
    • Total Pages
      15
    • Publisher
      Springer press

URL: 

Published: 2013-07-10  

Information User Guide FAQ News Terms of Use Attribution of KAKENHI

Powered by NII kakenhi