新規平面脂質膜を用いた細胞膜分裂装置ｄｉｖｉｓｏｍｅの形成過程と構造の解明

2011 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 23770173
• Research Institution: Yamagata University
• Principal Investigator: 奥野 貴士 山形大学, 理学部, 准教授 (80411031)
• Project Period (FY): 2011-04-28 – 2014-03-31
• Keywords: 細胞膜分裂 / 膜蛋白質

Research Abstract

本研究は、大腸菌の膜分裂時の分裂面に集合し、分裂を調節する膜蛋白質複合体(Divisome)を構成する膜蛋白質の相互作用,ダイナミクス,構造を明らかにする事を目的として、初年度の研究を実施した。試験管内に大腸菌の膜成分を平面状に展開し、divisomeの構築過程の蛍光イメージング解析を行う。研究初年度は、divisomeを構成する膜タンパク質の蛍光イメージング解析のための、蛍光蛋白質を融合した発現株の構築と膜蛋白質の調製を行った。　本年度は、divisome形成の初期に複合体を形成するFtsZ, ZipA, FtsKのGFP融合蛋白質の大量発現系を検討し、それぞれのGFP融合蛋白質のIPTG誘導による発現をSDS-PAGEおよび蛍光顕微鏡で確認した。発現確認後、FtsK-GFP融合蛋白質を含む細胞膜画分の調製を行った。本研究費で購入した高圧細胞破砕装置を用いて、大腸菌を破砕後、超遠心により細胞膜成分にFtsK-GFPが含まれる事をSDS-PSGEおよび蛍光顕微鏡観察により確認した。さらに本研究では、それらGFP融合蛋白質を含む大腸菌膜画分から膜小胞を調製し、大腸菌抽出脂質で作製したリポソームとの融合条件を検討した。その結果、高圧細胞膜破砕時に、リポソームを細胞懸濁液に混合することで、膜小胞とリポソームが融合し、数十μm程度の大きさの巨大な多重膜ベシクルの調製に成功した。得られた巨大な多重膜ベシクルは、平面脂質構造体の作製に重要な構造体であり、大腸菌の膜蛋白質すべてを含む平面脂質膜作製のための大きな進歩である。研究目標達成に向けて概ね計画とおり進める事ができた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

研究計画初年度においては、divisomeを構成する膜蛋白質の発現系構築と膜タンパク質の調製を実施する計画であった。さらに調製した膜蛋白質間の相互作用をFRETとして観察する予定であった。上記、設定した初年度の到達目標に対して、膜蛋白質の調製に成功し、また平面膜構造体の作製のための手がかりを得る事ができ、概ね初年度の研究計画を達成した。しかし、３月の震災に伴う細胞破砕装置の導入が遅れ、膜蛋白質調製が当初の計画より半年ほど遅れた。そのために、蛋白質間相互作用のFRET観察までには至っていない。しかし、実施計画の遅れの程度は大きくなく、残りの２年間の研究期間内で研究目標を達成する事は可能である。全体の研究計画における達成度としては、概ね達成出来ているとの評価に至った。

Strategy for Future Research Activity

次年度も引き続き、蛍光蛋白質を融合したZipA, FtsKが過剰発現した膜画分で作製した反転膜小胞から、平面脂質膜を作製する実験条件を検討する。さらに分子間の相互作用を蛍光顕微鏡観察を用いて解析していく。また、全反射顕微鏡を用いて、膜蛋白質がdivisomeを形成する過程のダイナミクス等をより詳細に解析していく。次年度は、平面膜作製をより確実に達成するために、ガラス基板上に微細加工技術により作製した基板上に反転膜小胞を展開する実験も行う。より生体膜に近い環境で膜分裂を制御するdivisome膜蛋白質の解析系も開発していく。概ね当初の研究目標、計画に従ってH24年度の研究を実施する。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

研究費は当初の計画とおり主として研究を実施するための試薬、プラスチック製品などの消耗品購入およびガラス基板作製に充てる。本年度は、研究室に所属し、本研究を実施する学生数も増える事に伴い、購入する物品費が昨年度よりも多くなる事が予測される、ためH23年度に生じた繰越金（22万円程度）を、試薬および消耗品に充てる。また、昨年度の研究成果を国内学会での発表を計画している。