2012 Fiscal Year Research-status Report
新規平面脂質膜を用いた細胞膜分裂装置ｄｉｖｉｓｏｍｅの形成過程と構造の解明
| Project/Area Number |
23770173
|
|---|
| Research Institution | Yamagata University |
|---|
Principal Investigator |
奥野 貴士 山形大学, 理学部, 准教授 (80411031)
|
|---|
| Keywords | 膜分裂 |
|---|
| Research Abstract |
平面脂質膜上に、大腸菌の細胞分裂装置であるdivisomeを再構築し、構造および機能解析を目的として研究を実施している。本年度は主として、蛍光ラベル化FtsZを用いて蛍光顕微鏡による観察条件および脂質膜との相互作用を検証した。また、FtsZと脂質膜を介するZipAの調製を主として実施した。また、平面脂質膜の構造および物性解析も同時に進行させた。Cy3-FtsZを調整後、GTP依存的に繊維構造を形成させたところ、顕微鏡下で繊維構造を観察できる条件を検討した。結果としてFtsZ繊維が束になった状態の繊維を顕微鏡で観察可能となり、本研究の目標達成に重要な条件を決定する事ができた。また、GFPを融合したZipAの大腸菌の過剰発現株の確立を試みた。現時点で、精製後、実験に用いる十分なタンパク質量を得るまでには至らず、今後、宿主および発現ベクター等を変えることで、収量の向上を目指す。膜タンパク質を解析する平面脂質の作製方法についても検討した。これまでは、大腸菌抽出脂質を用いて平面膜を作製してきたが、膜の脂質組成を明確にするために、合成脂質を用いて気-液界面の脂質膜作製条件を検討した。現時点において、少なくともカルジオリピンは平面膜作製に必要がない事が明らかとなった。PE,PGを中心に、平面膜を効率よく形成する脂質膜組成を検討する必要がある事がわかった。また、膜分裂に関与するタンパク質すべてを用いて、再構築する実験へと発展させている。大腸菌の細胞膜成分（タンパク質を含む）から平面膜を作製し、膜分裂装置のイメージング解析を可能とする実験系の構築への手がかりも見いだした。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究は、細胞膜がくびれる現象を制御するタンパク質群の相互作用と構造解析を行い、膜分裂がどのように制御されているかを解明する事を目的としている。分裂を駆動する因子（タンパク質）を試験管内に再構築し、蛍光顕微鏡によるイメージング解析および電顕による構造解析を計画してきた。H24年度終了時の２年間の研究において、計画するタンパク質の蛍光ラベルおよびGFP融合タンパク質の調製を実施してきた。また、膜タンパク質を解析するためのモデル膜についても、作製方法および物性解析を実施してきた。まだ、タンパク質間の相互作用をFRETとして観察する段階には入っていないが、分裂の足場となるFtsZの繊維構造解析を中心にすすめており、順次相互作用解析を実施する。脂質平面膜の作製方法についても、イメージング解析が十分可能な量(面積）を得る条件を確立している。膜タンパク質調製および平面脂質膜調製においてもおおむね順調に進展しており、最終年度に計画するイメージング解析および構造解析を展開する。
|
| Strategy for Future Research Activity |
平成２５年度は、これまでに作製した蛍光ラベルタンパク質の平面脂質膜上における相互作用をイメージング解析を実施する予定である。FtsZは、GTP依存的に繊維構造を形成するが、細胞内においては分裂面で、ZipA等を介して膜表面に結合し、繊維が束になることが提案されている。平面脂質膜表面に再構築したZipA等のアンカータンパク質とFtsZの繊維がどのように相互作用していくかを明らかにする。さらに、その膜を電子顕微鏡観察による構造解析を実施する。また、分裂を制御するタンパク質は多く、すべての膜タンパク質の再構築の困難が予測される。そこで大腸菌の内膜そのものを用い、試験管内に分裂装置をくみ上げる実験系構築も並行して実施する。
|
| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
研究費は主として、タンパク質の精製および脂質膜作製を行う試薬に主として計上する予定である。また、研究成果の報告のために、国内学会への参加を予定している。
|
Research Products
(1 results)
