2011 Fiscal Year Research-status Report
ホスホコリンシチジリルトランスフェラーゼの活性化制御機構と分泌系機能調整の解析
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23780348
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| Research Institution | Fukushima Medical University |
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Principal Investigator |
荒井 斉祐 福島県立医科大学, 医学部, 助教 (30528261)
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| Project Period (FY) |
2011-04-28 – 2013-03-31
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| Keywords | ホスホコリンシチジリルトランスフェラーゼ / 小胞体 |
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| Research Abstract |
Phosphatidylcholine(PC)合成経路において，PC合成量に関与している律速酵素Phosphocholine cytidylyltransferase(CCT)には，2つのアイソフォームが存在する．本年度は，CCTβに焦点を当て，その活性化制御機構を解析し，真核生物において非常に厳密に行われている細胞内PC量の制御機構を解明する事を目的とした．CCTβに蛍光タンパク質を付加し細胞内動態を検討した結果，CCTβ-GFPの局在は細胞質であり，CCT活性を増大させるオレイン酸を培地に添加すると，その局在が小胞体へと変化した．アミノ酸置換により様々なCCTβ変異体を作製，解析した結果，CCTβは，細胞質においてはリン酸化状態で存在し，小胞体に局在する事で脱リン酸化状態になる事を見出した．種々のPhosphatase阻害剤やsiRNAによるProtein phosphataseのノックダウン実験を行った．その結果，小胞体膜タンパク質でありCeramidet ransport protein：CERTの脱リン酸化に関与しているPP2Cεが，小胞体に局在したCCTβを脱リン酸化させる事を明らかとした．また，アラニンスキャニングによりリン酸サイトを探索した結果，Phosphorylationドメインに存在する3つのセリンと1つのスレオニンである事が分かった．CCTβは，立体構造変化に伴い，その局在を小胞体に変化させ，小胞体においてPP2Cεにより脱リン酸化される事で活性型へと変化する事を明らかとした．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度の研究目標は,CCTβの膜へのトランスロケーションとリン酸化状態を解析する事であった．膜へのトランスロケーションはCCTβの立体構造に依存する事，脱リン酸化酵素の同定，リン酸化ドメインの決定と，ほぼ解析は終了したと考えている．
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| Strategy for Future Research Activity |
CCTβ発現抑制は，分泌系タンパク質の輸送異常という表現型をもたらした．この表現型の解析により，分泌系でのカーゴ輸送における律速過程で最も解明されていない小胞体からゴルジ体への輸送過程，また直接的に関与が示されていなかったリン脂質とカーゴの成熟の関係について解明する．この表現型は，PC合成量低下によるものか，CDP-Cholineや他の脂質の影響により生じるのかを調べる．いずれでもない場合，CCTβによるカーゴタンパク質の成熟機構の新たな生理活性として研究を遂行する．
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
主に，一般試薬，細胞培養試薬，プラスチック製品等の消耗品の購入に使用する．また，2回の学会発表を予定しており，その旅費などに関しても使用する．
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