2011 Fiscal Year Research-status Report
肺サーファクタント蛋白質Ａによる非感染性肺障害の炎症制御
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23790915
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| Research Institution | Sapporo Medical University |
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Principal Investigator |
黒沼 幸治 札幌医科大学, 医学部, 助教 (40563250)
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| Project Period (FY) |
2011-04-28 – 2013-03-31
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| Keywords | ブレオマイシン / 非感染性肺障害 / 肺サーファクタント / Toll様受容体 |
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| Research Abstract |
本研究の目的は非感染性肺障害の発症・増悪過程における肺サーファクタントの生体防御作用機序を明らかにし、さらに分子治療の可能性を追求する事である。具体的にはSP-A遺伝子欠損マウスを用いて肺サーファクタント分子の欠損が肺障害に及ぼす影響を検討し、自然免疫に関連したサイトカインや遺伝子発現変化も検証する。１）マウスブレオマイシン肺障害モデルを作成した。経気道投与と皮下投与の2種類のモデルを作成し、比較検討を行った。C57BL6マウス（週齢8週）に対してペントバルビタール腹腔内投与による麻酔下にブレオマイシンをマイクロスプレイヤーを用いて経気管的に肺内投与し、肺障害モデルを作成した。C57BL6マウス（週齢8週）に対してペントバルビタール腹腔内投与による麻酔下に浸透圧ポンプを用いてブレオマイシンを皮下持続投与し、肺障害モデルを作成した。２）SP-A遺伝子欠損マウスを用いて肺障害を検討した。野生型およびSP-A遺伝子欠損マウスにブレオマイシンを投与して肺障害モデルを作成したところ、SP-A遺伝子欠損マウスにおいてはより重篤な肺障害をきたし、投与１４日で全個体が死亡した。ホルマリン固定肺で強い炎症や好中球を主体とした細胞浸潤を認めた。気管支肺胞洗浄液中の細胞数は増加しており、特に肺胞マクロファージと好中球の増加を認めた。さらに、ELISA法によりTNF-αやKCなどのサイトカイン、ケモカインの増加を認めた。SP-Aの欠損により初期の炎症増悪が認められた事から、自然免疫制御との関連が示唆された。申請時に本計画で予測した現象としてToll様受容体（TLR）を介した免疫機構への関与を今後検討していく予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
マウスを用いた非感染性肺障害モデルを確立することができた。また、SP-A遺伝子欠損マウスと野生型マウスにおける肺障害の比較も組織所見や気管支肺胞洗浄液中のサイトカインの測定によって検討することが出来た。SP-A遺伝子欠損マウスにおいてはより重篤な肺障害をみとめたことは当初の計画どおりであったため、目的はおおむね達成している。
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| Strategy for Future Research Activity |
１）マクロファージ細胞を用いてブレオマイシン誘導シグナルを解明する。２）HEK293細胞にTLR2,CD14,TLR4,MD-2などの細胞表面受容体の遺伝子を導入し、ブレオマイシンによるNF-κBの誘導を検討する。また、肺サーファクタントが及ぼす影響を検討し、シグナル伝達経路を解明する。３） 分子間の結合を調べるため、ビアコアを用いてブレオマイシンとTLR2、TLR4の細胞外ドメイン（ｓTLR2,ｓTLR4）を合成した蛋白との結合を検討する。４）ブレオマイシンをビオチン標識し、ｓTLR2,ｓTLR4との結合を免疫沈降法を用いて検討する。また、その結合がSP-A,SP-Dにより阻害されるかどうか調べる。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
本年度予算から残額707,862円となったが、東日本大震災の影響で学会が中止になったことも有り、発表できなかったことや、研究試薬の納入に時間がかかり、進行に影響したことに起因する。次年度には国内や海外において学会発表を行う。次年度の主な研究はin vitroや分子間の相互作用の研究に移行する見込みであり、各種試薬を購入する予定である。高額な機材の購入予定はない。in vivo実験を引き続き行うためにマウスを購入する。また、次年度中に可能であれば論文を作成し、投稿したいと考えている。
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