2011 Fiscal Year Research-status Report

シェーグレン症候群でのＭ３ムスカリン作働性アセチルコリン受容体に対する免疫応答

Research Project

Project/Area Number	23791100
Research Institution	University of Tsukuba
Principal Investigator	坪井洋人筑波大学, 医学医療系, 講師 (80580505)
Project Period (FY)	2011-04-28 – 2013-03-31
Keywords	シェーグレン症候群 / 自己免疫疾患 / 自己抗体 / M3ムスカリン作働性アセチルコリン受容体 / 自己反応性T細胞
Research Abstract	【目的】シェーグレン症候群（SS）において、近年注目されている自己抗原であるM3ムスカリン作働性アセチルコリン受容体（M3R）に対する免疫応答を明らかにする。1）抗M3R抗体　SSの疾患特異性を明らかにする。2）M3R反応性T細胞　SS患者の末梢血中において、M3R反応性T細胞の存在を明らかにする。【方法】1）抗M3R抗体　疾患コントロールとして、関節リウマチ（RA）21例、全身性エリテマトーデス（SLE）21例、原発性胆汁性肝硬変（PBC）84例、後天性無汗症12例の血清を用いて、M3R合成ペプチド（N末端、第1・2・3細胞外ループ）を抗原としたELISAにより、抗M3R抗体を測定した。2）M3R反応性T細胞　抗M3R抗体陽性SS患者のうち、PBMCの採取が可能な患者を抽出した。【結果】1）抗M3R抗体　N末端に対する抗M3R抗体は、RAで42.9％（9/21例）、SLE28.6％（6/21例）、PBC90.5％（76/84例）、後天性無汗症16.7％（2/12例）の陽性率であった。第1細胞外ループに対する抗M3R抗体は、それぞれ、33.3％（7/21例）、28.6％（6/21例）、72.6％（61/84例）、0％（0/12例）の陽性率であった。第2細胞外ループに対する抗M3R抗体は、それぞれ、33.3％（7/21例）、57.1％（11/21例）、76.2％（64/84例）、0％（0/12例）の陽性率であった。第3細胞外ループに対する抗M3R抗体は、それぞれ、33.3％（7/21例）、28.6％（6/21例）、69.0％（58/84例）、0％（0/12例）の陽性率であった。2）M3R反応性T細胞　3例のSSが抽出された。【結論】RA、SLE、PBCにおいても抗M3R抗体が検出され、特にPBCでは高い陽性率であった。一方で後天性無汗症では抗M3R抗体は検出されなかった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 抗M3R抗体の疾患特異性の検討については、順調に疾患コントロールの血清採取が進み、抗M3R抗体の測定を行うことができた。一方で、抗M3R抗体の機能解析に関しては、次年度での検討が必要である。また、より多数例のSSで抗M3R抗体を測定し、抗体の有無と臨床像との関連の解析を進める。また、M3R反応性T細胞の解析に関しては、現時点では解析対象SS患者の抽出と、PBMCからIFNγおよびIL-17 産生細胞をMACS cytokine secretion assayを用いて検出・分離する系の条件設定の段階である。次年度SS患者PBMC中のM3R反応性T細胞を単離し、TCRのレパトア解析、CDR3領域のsequenceを行い、クローナリティーの解析を行う予定である。
Strategy for Future Research Activity	1）抗M3R抗体　多数例のSSで抗M3R抗体をM3R合成ペプチド（N末端、第1・2・3細胞外ループ）を抗原としたELISAで測定し、抗体の有無と臨床像（唾液・涙液分泌、角結膜障害、M3Rアゴニストに対する反応性）との関連を解析する。また、ヒト唾液腺（HSG）細胞株を抗M3R抗体陽性および陰性SS、健常人のIgGと共培養し、HSG細胞株表面のM3R発現を免疫蛍光法・Western Blot法で比較する。2）M3R反応性T細胞　抗M3R抗体陽性および陰性SS患者のPBMCをM3R合成ペプチド（N末端、第1・2・3細胞外ループ）で刺激し、M3Rに反応してIFNγおよびIL-17を産生するM3R反応性T細胞をMACS cytokine secretion assay（IFNγ、IL-17）を用いて単離し、TCRのレパトア解析、CDR3領域のsequenceを行い、クローナリティーの解析を行う。
Expenditure Plans for the Next FY Research Funding	ELISAの抗原、PBMCの刺激抗原として用いるM3Rペプチド（N末端、第1・2・3細胞外ループ）を、それぞれ10mg合成する。また、MACS cytokine secretion assay（IFNγ、IL-17）に必要なキット、細胞分離に必要なMACSカラムを購入する予定である。