生体材料と成長因子の相互作用を応用した軟骨細胞無血清培地の開発

2013 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 23792273
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 倉林 くみ子 東京大学, 医学部附属病院, その他 (40586757)
• Keywords: 無血清培地

Research Abstract

成長因子と生体材料の細胞増殖における相互作用の分子メカニズムを検討した。まず各因子と材料の細胞増殖効果への相互作用の分子メカニズムを解析する。増殖因子と生体材料と直接混和せず十分に相互作用をさせない方法および、十分に混和し相互作用させる方法での細胞増殖効果を比較した。具体的には上記両群において、各成長因子の半減期のELISA等を用いて測定するとともに、Western　blotting を用いて細胞増殖シグナルの活性化について、経時的に測定した。
また、開発した無血清培地を用いた各種細胞の増殖曲線の検討をした。耳介軟骨細胞の他に、鼻中核軟骨細胞、アストロノーマ、気管上皮細胞、ケラチノサイト、iPS細胞、などについて、無血清培地にて培養した際の経時時的な細胞増殖曲線を作成する。各種細胞を無血清培地にて7日間培養後、ヌクレオカウンターを用いて細胞数を評価する。
無血清培地にて増殖培養した耳介軟骨細胞を用いた再生軟骨の作製した。無血清培地にてヒト耳介由来軟骨細胞を第3継代まで培養後、高密度(108 cells/ml)で1％アテロペプチドコラーゲンに包埋し、ペレット型軟骨細胞の遺伝子発現および蛋白蓄積量を評価する。Insulin、T3とBMP-2を含む再分化誘導培地により、1週間培養後、I型コラーゲンおよびII型コラーゲンの発現をreal time RT-PCR にて測定した。また3週間培養後、I型コラーゲン、II型コラーゲン、GAG蓄積量をELISAや比色定量法を用いて測定する。さらに、無血清培地で増殖培養した軟骨細胞をPLLA足場素材に播種し、再生軟骨組織の作製し、ヌードマウスへ移植する。移植後2週、2ヶ月、6ヶ月で再生軟骨を回収し、再生組織内の形状評価、組織学的・生化学的解析を行った。