2023 Fiscal Year Research-status Report
超並列分散処理の細胞実装機構を解明するイメージング法の開発
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23K18168
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
高木 朗子 (林朗子) 国立研究開発法人理化学研究所, 脳神経科学研究センター, チームリーダー (60415271)
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| Project Period (FY) |
2023-06-30 – 2025-03-31
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| Keywords | シナプス / 2軸2光子顕微鏡 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
マウスの前頭野と他の脳領域を同時に観察できる高解像（シナプス解像）度の2軸2光子顕微鏡システムをこれまでに作成していた。今年度は、当該顕微鏡の光学性能を校正用微細蛍光ビーズの蛍光値や形状を測定し、その値よりXYZ軸のPSFを定量し、満足すべきレベルまで到達したことを確認した。また2軸の光学系が同期してイメージングすることが重要であるが、レゾナントスキャナーの物理的性質のため、各軸の振動周期を完全に同期することは難しい。そこで、両軸が１フレーム事にどの程度の時間的ズレが生じるかを検証した結果、740フレーム（約3分間）のイメージングをおこなうと、最終フレームでは両軸に10ミリ秒のズレが生じることが分かった。これ以上の2軸同期は物理的に困難であると判断し、各フレームイメージのタイムスタンプ情報を元に、Post hocで両軸のイメージングを時間的に同期するためのシステム構築を行い、これを完了した。次に、この新規顕微鏡の性能を引き出せるための最適なイメージング法の確立を目指した。すなわち、2光子観察窓作製、グリンレンズ挿入、ヘッドプレート装着である。前頭野を標的とした観察窓の作製は従来どおりで実行可能であるが、前頭野用の対物レンズに干渉しないように扁桃体へのグリンレンズ挿入を行い、その際に、どの脳領域が破壊されるかを3D CADデータより算出し、アクセス角度の条件をシミュレーションした。そして手術中の灌流液の種類、脳実質をどの程度吸引して扁桃体まで到達すると良好な結果が得られるかを実際の実験で比較した。このような繰り返し実験により、2軸2光子イメージングのための手術法に一応の目処がついた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
新規顕微鏡の光学調整を行い、その性能を校正用微細蛍光ビーズの蛍光値や形状より定量し、満足すべきレベルまで到達した。2つの方向からの頭部観察窓作成術に関しても、扁桃体と前頭葉に到達するためのアクセスおよび手術法に一応の目処がついた。
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| Strategy for Future Research Activity |
最適化した2軸イメージング法を用いて、恐怖条件付けモデルにおける「消去（Extinction）」の解析を行う。活動依存的に神経細胞を可視化するESARE:: tdTomato、活動依存的に神経前部を可視化するESARE::VAMP2-mTurquoise2、および24時間以内に新生・増大した樹状突起スパインを特異的に標識しAS-PaRac1を用いた予備実験により、ストレス負荷後に、前頭野と扁桃体の神経細胞群が活発に活動し、シナプス可塑性が生じていることが明らかになったため、この回路に着目し、前頭野および扁桃体の2色Ca2+イメージングを行う。シナプスレベルの詳細な解析のためには、別コホートを準備し、シナプス入力をiGluSnFrのイメージング解析、スパイン体積変化解析を行う。データの解析法の確立と共に、このデータを元にモデル化を試みる。
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| Causes of Carryover |
本予算で購入予定であった消耗品に関しては、繰越の出来ない運営費で購入したため。そのため未使用となった本予算に関しては次年度使用とし、次年度に精力的に実験を行える環境にあることも踏まえて、そのような判断となった。
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