ゲノム・エピゲノム編集をもちいたダウン症候群の知的障害に対する遺伝子治療法開発

2022 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 22H03039
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 北畠 康司 大阪大学, 医学部附属病院, 准教授 (80506494)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2027-03-31
• Keywords: ダウン症候群 / ゲノム編集 / エピジェネティック編集 / iPS細胞

Outline of Annual Research Achievements

ダウン症候群は21番染色体のトリソミーによって引き起こされる代表的な遺伝性疾患である。申請者らはこれまで、疾患特異的iPS細胞とゲノム編集技術を組み合わせダウン症の中枢神経病態の解析を行ってきた。健常アストロサイトは本来、神経細胞への保護作用をもっており、両者を共培養すると神経細胞のアポトーシスが抑制されるが、ダウン症アストロサイトではこの保護作用が消失するばかりか、神経細胞に過剰なアポトーシスを誘導してしまう。ダウン症アストロサイトでは自然免疫の重要な鍵を握る“NLRP3インフラマソーム”の活性が著しく上昇していること、さらにその責任遺伝子として、21番染色体上のDYRK1A を同定することに成功した。そこで本研究課題ではこのDYRK1Aに注目し、ゲノム編集・エピジェネティック編集をもちいることでその発現量を抑制することによる治療法開発を目指している。
真下らによって開発された新しいゲノム編集技術であるCRISPR-Cas3は、数塩基の切断しか行わないCas9とは異なり、最大数十kbもの大規模な塩基欠失を引き起こすという大きな特徴をもち、またオフターゲット効果がCRISPR-Cas9と比較して低い。そこでDYRK1Aの3アレルのうちの1つだけがもつSNPと組み合わせてCRISPR-Cas3を作用させることで、DYRK1Aの正確なコピー数補正を試みた。また、切断活性を失くしたdead Cas9 (dCas9)に転写制御因子やヒストン修飾酵素を融合させ、DNAメチル化を変化させることで標的領域の遺伝子発現を自由に制御することのできるエピジェネティック編集を用いて、DYRK1Aの発現制御を試みた。その結果、in vitroにおいていずれもDYRK1Aの発現量低下を確認することができた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

2022年度は新規のゲノム編集技術であるCRISPR-Cas3およびエピジェネティック編集の利用可能性について検証を行った。その結果、CRISPR-Cas3がiPS細胞およびアストロサイトにおいて効果的にゲノム切断を引き起こし、DYRK1Aのゲノム量補正ならびに発現量低下をもたらすことを確認することができた。さらに切断活性を失くしたdead Cas9 (dCas9)にDNMT3A、3L、KRABをつないだCRISPRoffベクターを用いることにより、DYRK1Aの転写開始点近傍のDNAメチル化を変化させること、DYRK1Aの発現量を低下させることに成功した。

Strategy for Future Research Activity

今年度は転写開始点近傍のアレル特異的SNPを探しだし、アレル特異的な発現量低下を目指すこと、さらにダウン症モデルマウスを用いて、その神経発生に及ぼす影響について検討を進めたい。
具体的には、妊娠したダウン症モデルマウスの子宮内胎児の脳室内に脂質ナノ粒子を用いてCRISPRoff mRNAを投与し、出生後の神経・アストロサイトの細胞数を確認する。そのためには神経系送達可能な脂質ナノ粒子の開発が必要であり、その検討も進める。