肝細胞のがん化における細胞間相互作用を介した星細胞の役割

2022 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 22H03061
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Institution: Osaka Metropolitan University
• Principal Investigator: 河田 則文 大阪公立大学, 大学院医学研究科, 教授 (30271191)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 松原 三佐子 (佐藤三佐子) 大阪公立大学, 大学院獣医学研究科, 准教授 (00635120) ; LE THITHANHTHUY 大阪公立大学, 大学院医学研究科, 特任講師 (10572175) ; HOANG HAI 大阪公立大学, 大学院医学研究科, 研究員 (60623246)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: 星細胞 / 肝線維化 / Cytoglobin / コラーゲン / TGF-β / ROS

Outline of Annual Research Achievements

肝癌発生に関してin vivo発がんモデルで検討した。野生型とサイトグロビン（Cytoglobin）ノックアウトマウスのそれぞれに、15日齢時に体重1 kgあたり6 mgのDiethylnitrosamine（DEN）を腹腔内投与し、12ヶ月間に亘って腫瘍形成を観察した。最終時点で肝臓と血清を採取し、一部のグループ（n = 3匹/グループ）は、単一細胞解析に使用した。門脈灌流により肝臓から非実質細胞を分離し、プロナーゼ・コラーゲナーゼ酵素的灌流法により単一細胞を採取し、洗浄、赤血球と死細胞を除去し、100万細胞/mlに調整し、細胞生存率はTrypan blue法で評価した。サンプルは、Chromium single cell 3' reagent kits version 2、chip and controller（10 X Genomics）を使用してドロップレットベースのRNA-seqで処理され、メーカーの推薦する条件に指示に従って解析した。
3つの非実質細胞タイプ、肝星細胞（HSC）、クッパー細胞（KC）、肝類洞内皮細胞（LSEC）の特定マーカーを使用し、アノテーションステップでの初期データ解析を行ったところ、DEN処理された肝臓ではKCに2つのサブクラスター、LSECに4つのサブクラスター、およびHSCに4つのサブクラスターがあることが判明した。 CytoglobinノックアウトマウスのLSECとWTマウスのLSECを比較したところ、異なる遺伝子発現があることが判明し、log2が1以上とした場合150の遺伝子が変化した。変化したトップ10遺伝子には、Rgs5、Apoa2、Serping1、Gm8797、Fgb、Mup10、Sod3、Chchd2、Cxcl12、Ifitm1が含まれていた。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

野生型、サイトグロビンノックアウト、サイトグロビン過剰発現マウスの3つの系統にDiethylnitrosamine（DEN）を投与すると、サイトグロビンノックアウトマウスでは肝腫瘍の促進、サイトグロビン過剰発現マウスでは肝腫抑制が観察された。肝腫瘍形成における肝微小環境の役割を調べるため、シングルセルシーケンシング解析を行なった。小動物からの細胞分離についてはすでに確立されたプロトコールがあり、高品質な非実質細胞を用いて10 Xジェノミックシングルセルシーケンシングを行い結果が出揃っており、解析に入っている。さらに、ホルムアルデヒドで固定された単一細胞および核懸濁液中の遺伝子発現を測定する包括的かつスケーラブルなソリューションを提供する最新技術のChromium Fixed RNA Profilingの使用を行う実験も現在進行中である。

Strategy for Future Research Activity

非実質細胞集団は、DENに暴露された野生型マウスとサイトグロビンノックアウトマウスの間で相違があることが判明した。加えて、LSECsが肝微小環境の形成に大きく関与していることも見出した。これらの成果を下に、2023年度は以下の検討を行う：
①DEN投与グループにおけるLSECs由来の入出信号の解析。
②LSECsと肝星細胞、およびマクロファージの間のリガンド-受容体相互作用。
③腫瘍異質性と腫瘍微小環境の相互関係を探索。

Research Products

• [Journal Article] In Vitro Models for the Study of Liver Biology and Diseases: Advances and Limitations. (2023)
  • Author(s): Kaur S*, Kidambi S*, Ortega-Ribera M*, Thuy LTT*, Nieto N, Cogger V, Xie WF, Frank Tacke, Gracia-Sancho J
  • Journal Title: Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology Volume: 15 Pages: 559-571
  • DOI: 10.1016/j.jcmgh.2022.11.008
  • Open Access
• [Journal Article] Gasdermin D-mediated release of IL-33 from senescent hepatic stellate cells promotes obesity-associated hepatocellular carcinoma. (2022)
  • Author(s): Yamagishi R, Kamachi F, Nakamura M, Yamazaki S, Kamiya T, Takasugi M, Cheng Y, Nonaka Y, Yukawa-Muto Y, Thuy LTT, Harada Y, Arai T, Loo TM, Yoshimoto S, Ando T, Nakajima M, Taguchi H, Ishikawa T, Akiba H, Miyake S, Kubo M, Iwakura Y, Fukuda S, Chen WY, Kawada N, Rudensky A, Nakae S, Hara E, Ohtani N
  • Journal Title: Sci Immunol Volume: 7 Pages: eabl7209
  • DOI: 10.1126/sciimmunol.abl7209
  • Open Access
• [Journal Article] Soluble immune checkpoint protein CD27 is a novel prognostic predictor that controls the development of liver cancer (2022)
  • Author(s): Dong MP*, Thuy LTT*, Dinh VH, Hai H, Truong HH, Sato-Matsubara M, Hieu VN, Daikoku A, Hanh NV, Urushima H, Ninh QD, Uchida-Kobayashi S, Enomoto M, Ohtani N, Tamori A, and Kawada N
  • Journal Title: American Journal of Pathology Volume: 192 Pages: 1379-1396
  • DOI: 10.1016/j.ajpath.2022.07.003
  • Open Access
• [Journal Article] Cancer cells produce liver metastasis via gap formation in sinusoidal endothelial cells 2 through pro-inflammatory paracrine mechanisms (2022)
  • Author(s): Truong Huu Hoang, Misako Sato-Matsubara, Hideto Yuasa, Tsutomu Matsubara, Le Thi Thanh Thuy, Hiroko Ikenaga, Dong Minh Phuong, Ngo Vinh Hanh, Vu Ngoc Hieu, Dinh Viet Hoang, Hoang Hai, Yoshinori Okina, Masaru Enomoto, Akihiro Tamori, Atsuko Daikoku, Hayato Urushima, Kazuo Ikeda, Ninh Quoc Dat, et al.
  • Journal Title: Science Advances Volume: 8 Pages: eabo5525
  • DOI: 10.1126/sciadv.abo5525
  • Open Access
• [Journal Article] Anti-fibrotic Capacity of Extracellular Globins via Scavenging Reactive Oxygen Species and Promoting MMP-1 Secretion (2022)
  • Author(s): Hieu VN *, Thuy LTT*, Hai H, Ninh QD, Dinh VH, Hanh NV, Dong MP, Truong HH, Sawai H, Shiro Y, Sato-Matsubara M, Oikawa D, Tokunaga F, Ohtani N, Yoishizato K, and Kawada N
  • Journal Title: Redox Biology Volume: 52 Pages: 102286
  • DOI: 10.1016/j.redox.2022.102286
  • Open Access
• [Journal Article] Cytoglobin attenuates pancreatic cancer growth via scavenging reactive oxygen species (2022)
  • Author(s): Dinh VH*, Thuy LTT*, Hai H, Hieu VN, Kimura K, Oikawa D, Ikura Y, Ninh QD, Hoang TH, Sato-Matsubara M, Dong MP, Hanh NV, Uchida-Kobayashi S, Tokunaga F, Kubo S, Ohtani N, Yoishizato K, and Kawada N
  • Journal Title: Oncogenesis Volume: 11 Pages: 23
  • DOI: 10.1038/s41389-022-00389-4
  • Open Access
• [Presentation] Baseline sCD27, sCD28, and sCD40 levels - novel predictors of HCC development in HCV-SVR patients (2023)
  • Author(s): Le Thi Thanh Thuy, Minh Phuong Dong, Hoang Hai, Sawako Uchida-Kobayashi, Masaru Enomoto, Akihiro Tamori and Norifumi Kawada
  • Organizer: the 32nd Annual Meeting of Asian Pacific Association for the Study of the Liver (APASL)
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Soluble immune checkpoint protein CD27 is a novel prognostic predictor of HCC development in HCV-SVR patients (2022)
  • Author(s): Le Thi Thanh Thuy, Minh Phuong Dong, Hoang Hai, Vu Ngoc Hieu, Dinh Viet Hoang, Sawako Uchida-Kobayashi, Masaru Enomoto, Akihiro Tamori and Norifumi Kawada
  • Organizer: Annual Meeting of American Association for the Study of Liver Diseases (AASLD)
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Anti-fibrotic Capacity of Extracellular Globins via Scavenging Reactive Oxygen Species (2022)
  • Author(s): Le Thi Thanh Thuy, Vu Ngoc Hieu, Hoang Hai, and Norifumi Kawada
  • Organizer: XXI International Conference on Oxygen Binding and Sensing Proteins (O2BIP)
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Cytoglobin, Neuroglobin, Myoglobin, but not Hemoglobin Exhibited Anti-Fibrotic Properties In Vitro and In Vivo (2022)
  • Author(s): Le Thi Thanh Thuy, Vu Ngoc Hieu, Hoang Hai, Dinh Viet Hoang, and Norifumi Kawada
  • Organizer: the 58th Annual Meeting of the Japan Society of Hepatology