高機能等温核酸増幅酵素の創製と構造解析および病原体の現場での迅速検出への応用

2022 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 22H03332
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 保川 清 京都大学, 農学研究科, 教授 (30397559)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 福田 青郎 関西学院大学, 生命環境学部, 研究員 (30421283) ; 柳原 格 地方独立行政法人大阪府立病院機構大阪母子医療センター(研究所), 免疫部門, 部長 (60314415) ; 滝田 禎亮 京都大学, 農学研究科, 助教 (70263126) ; 藤原 伸介 関西学院大学, 生命環境学部, 教授 (90263219)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: 等温核酸増幅法 / リコンビナーゼポリメラーゼ増幅法 / ピルビン酸キナーゼ / 鎖置換DNAポリメラーゼ / uvsY

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、病原体の現場検出に最適と注目されている等温核酸増幅法であるリコンビナーゼポリメラーゼ増幅法（RPA法）で使用する、中温性のリコンビナーゼ（Rec）、一本鎖DNA結合タンパク質（SSB）、鎖置換DNAポリメラーゼ（Pol）、ATP再生酵素（ARE）の活性と安定性を、全アミノ酸スキャニング変異導入法により向上させる。一方、好熱性微生物から新規のRec、SSB、Pol、AREを取得し、活性と安定性を比較することを目的としている。①中温性のAREであるヒトピルビン酸キナーゼ（PK）を大腸菌で発現させ菌体から調製した。PKを使用したRPAは、従来から使用されているウサギクレアチンキナーゼ（CKr）を使用したRPAと同等の性能を有した。PKはCKrよりも高い耐熱性を有したことから、PKを使用したRPA試薬の高い保存安定性が示唆された。②好熱性細菌であるAeribacillus pallidus (H1) とGeobacillus zalihae (C1)から好熱性のPol（H1-PolとC1-Pol）を単離した。そしてH1-PolとC1-Polを大腸菌で発現させ菌体から精製した。H1-PolあるいはC1-Polを使用したRPAは、従来から使用されているBacillus stearothermophilus由来Pol（Bst-Pol）を使用したRPAよりも高い感度を有した。H1-Polを使用したRPAの凍結乾燥試薬は、少なくとも2週間室温に置いても、液状試薬と同程度の性能を有した。このことから、本凍結乾燥試薬は現場での使用に適していることが示唆された。③中温性のRecであるuvsYの溶解度を上げるために、Lys91-Glu134に変異を導入した全アミノ酸スキャニングライブラリーを作製した。600クローンをスクリーニングの結果、有望な変異体16種を単離した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

等温核酸増幅法は病原体の現場での迅速な検出に好ましいが、使用するタンパク質・酵素が不安定なため試薬の冷凍保存が必要である。コロナパンデミック社会を迎え、環境を対象とした病原体検査が公衆衛生上喫緊の課題となり、試薬の常温保存が求められている。申請者らはこれまでに、耐熱型逆転写酵素と高活性DNAポリメラーゼを開発し、これらを用いて新型コロナウイルスのRT-PCRを開発した。本研究では、病原体の現場検出に最適と注目されている等温核酸増幅法であるリコンビナーゼポリメラーゼ増幅法（RPA法）で使用する、中温性のリコンビナーゼ（Rec）、一本鎖DNA結合タンパク質（SSB）、鎖置換DNAポリメラーゼ（Pol）、ATP再生酵素（ARE）の活性と安定性を、全アミノ酸スキャニング変異導入法により向上させる。一方、好熱性微生物から新規のRec、SSB、Pol、AREを取得し、活性と安定性を比較することを目的としている。2022年度は、①中温性のAREであるヒトピルビン酸キナーゼ（PK）、②好熱性細菌であるAeribacillus pallidus (H1) とGeobacillus zalihae (C1)由来の好熱性PolであるH1-PolとC1-Pol、③中温性のRecであるuvsYについて成果をあげた。

Strategy for Future Research Activity

・Rec：全アミノ酸スキャニングライブラリー法によりT4ファージ由来RecであるuvsXとuvsYの性能を向上させる。RadA、RadB、RadCの評価を行う。
・SSB：T4ファージ由来SSBであるgp32の抗体を取得し、これを用いたRPA法の新規な検出法を構築する。TmaSSBとTK1961の評価を行う。
・Pol：H1-Polの結晶を作製し、立体構造を解析する。
・ATP再生系酵素：PKの評価を継続する。TK0511の評価を行う。

Research Products

• [Journal Article] Recombinase polymerase amplification using novel thermostable strand-displacing DNA polymerases from Aeribacillus pallidus and Geobacillus zalihae (2023)
  • Author(s): Juma, K.M., Inoue, E., Asada, K., Fukuda, W., Morimoto, K., Yamagata, M., Takita, T., Kojima, K., Suzuki, K., Nakura, Y., Yanagihara, I., Fujiwara, S., and Yasukawa, K.
  • Journal Title: J. Biosci. Bioeng. Volume: 135 Pages: 282-290
  • DOI: 10.1016/j.jbiosc.2023.01.009
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Purification and characterization of a serine protease from the fruit of Ficus carica cultivar Masui Dauphine (2023)
  • Author(s): Tokonami, M., Horiguchi, A., Ueshima, N., Takita, T., Takahashi, T., Nishimura, K., and Yasukawa, K.
  • Journal Title: Biosci. Biotechnol. Biochem. Volume: 未定 Pages: 未定
  • DOI: 10.1093/bbb/zbad028
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Comparison of the stability of CYP105A1 and its mutants engineered for production of active forms of vitamin D (2022)
  • Author(s): Takita, T., Sakuma, H., Nilouyal, S., Ohashi, R., Nemoto, S., Yogo, Y., Yasuda, K., Ikushiro, S., Sakaki, T., and Yasukawa, K.
  • Journal Title: Biosci. Biotechnol. Biochem. Volume: 86 Pages: 444-454
  • DOI: 10.1093/bbb/zbac019
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Inhibition of α-amylase and α-glucosidase by Morus australis fruit extract and its components iminosugar, anthocyanin, and glucose (2022)
  • Author(s): Qiao, Y., Ikeda, Y., Ito, M., Kimura, T., Ikeuchi, T., Takita, T., and Yasukawa, K.
  • Journal Title: J. Food Sci. Volume: 87 Pages: 1672-1683
  • DOI: 10.1111/1750-3841.16098
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Crystal structure of Grimontia hollisae collagenase provides insights into its novel substrate specificity toward collagen (2022)
  • Author(s): Ikeuchi, T., Yasumoto, M., Takita, T., Tanaka, K., Kusubata, M., Hayashida, O., Hattori, S., Mizutani, K., Mikami, B., and Yasukawa, K.
  • Journal Title: J. Biol. Chem. Volume: 298 Pages: 102109
  • DOI: 10.1016/j.jbc.2022.102109
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Analysis of ribonucleotide content in the genomic DNA of ribonuclease H2 A subunit (RH2A)-knockout NIH3T3 cells after transient expression of wild-type RH2A or RH2A variants with an Aicardi-Goutieres syndrome-causing mutation (2022)
  • Author(s): Kandabashi, M., Yano, H., Hara, H., Ogawa, A., Kamoda, K., Ishibashi, S., Himeda, K., Baba, M., Takita, T., and Yasukawa, K.
  • Journal Title: J. Biochem. Volume: 172 Pages: 225-231
  • DOI: 10.1093/jb/mvac056
  • Peer Reviewed
• [Presentation] リボヌクレアーゼH2のCサブユニットの、 欠損およびエカルディーグティエール症候群関連変異が細胞に与える影響の解明 (2023)
  • Author(s): 原晴佳、矢野晴菜、神田橋眞子、赤澤佳穂、鴨田佳奈、松本響子、馬場美聡、滝田禎亮、保川清
  • Organizer: 日本農芸化学会関西支部 第524回講演会
• [Presentation] Grimontia hollisae コラゲナーゼ(Ghcol)のX線結晶構造 (2023)
  • Author(s): 保川清、池内健晃、安本瑞貴、上島聡音理、滝田禎亮、 田中啓友、楠畑雅、服部俊治、水谷公彦、三上文三
  • Organizer: 日本農芸化学会2023年度大会シンポジウム
  • Invited
• [Presentation] シマグワ製品による αーグルコシダーゼの阻害 (2023)
  • Author(s): 西本創、池田祐輝、喬穎、南秀明、伊東昌章、 木村俊之、滝田禎亮、保川清
  • Organizer: 日本農芸化学会2023年度大会
• [Presentation] Caco-2細胞および陰イオン交換クロマトグラフィーとパルスドアンペロメトリ検出の組み合わせを用いた1-デオキシノリジマイシンのα-グルコシダーゼ阻害活性の測定 (2023)
  • Author(s): 池田祐輝、西本創、喬穎、矢野晴菜、南秀明、伊東昌章、滝田禎亮、保川清
  • Organizer: 日本農芸化学会2023年度大会
• [Presentation] GH10 キシラナーゼXynRの315位の アミノ酸残基が好アルカリ性に与える影響 (2023)
  • Author(s): 中村友香、鍬田航平、鈴木愛美、安本瑞貴、滝田禎亮、中村聡、保川清
  • Organizer: 日本農芸化学会2023年度大会
• [Presentation] イチジク果実からのセリンプロテアーゼの精製と性状解析 (2023)
  • Author(s): 堀口星、床並実津希、上島直生、西村耕作、滝田禎亮、保川清
  • Organizer: 日本農芸化学会2023年度大会
• [Presentation] リボヌクレアーゼH2 AサブユニットをノックアウトしたヒトHEK293細胞への、野生型あるいはエカルディーグティエール症候群を引き起こす変異をもつRH2Aの一過性発現 (2023)
  • Author(s): 矢野晴菜、神田橋眞子、松本響子、原晴佳、馬場美聡、滝田禎亮、保川清
  • Organizer: 日本農芸化学会2023年度大会
• [Presentation] Grimontia hollisaeコラゲナーゼのX線結晶構造と酵素活性の解析 (2022)
  • Author(s): 安本瑞貴、池内健晃、上島聡音理、滝田禎亮、田中啓友、楠畑雅、林田治、服部俊治、水谷公彦、三上文三、保川清
  • Organizer: 第68回日本生化学会近畿支部例会
• [Presentation] Grimontia hollisaeコラゲナーゼの X線結晶構造と触媒反応から明らかになった コラーゲンに対する新規な基質特異性 (2022)
  • Author(s): 上島聡音理、滝田禎亮、安本瑞貴、池内健晃、田中啓友、楠畑雅、服部俊治、水谷公彦、三上文三、保川清
  • Organizer: 日本農芸化学会関西支部2022年度支部大会（第522回講演会）
• [Presentation] ヒトDNAポリメラーゼδのLeu606への変異導入がヌクレオチド選択に与える影響 (2022)
  • Author(s): 石橋周侑、神田橋眞子、上野凛、滝田禎亮、保川清
  • Organizer: 日本農芸化学会関西支部2022年度支部大会（第522回講演会）
• [Presentation] シマグワ実抽出物とその成分によるα-アミラーゼとα-グルコシダーゼの阻害 (2022)
  • Author(s): 池田祐輝、喬穎、伊東昌章、木村俊之、池内健晃、滝田禎亮、保川清
  • Organizer: 日本生物高分子学会2022年度大会
• [Presentation] Geobacillus stearothermophilus由来トランスグルタミナーゼのC末端伸長配列の役割の解明とX線結晶構造解析 (2022)
  • Author(s): 濱中雄大、京逸如、雷雨坤、山田章文、三上文三、水谷公彦、保川清、滝田禎亮
  • Organizer: 日本生物高分子学会2022年度大会
• [Presentation] Enzyme chemical and cell biological analysis of human RNase H2 bearing Aicardi-Goutieres syndrome causing mutations (2022)
  • Author(s): Kiyoshi Yasukawa, Misato Baba, Motoki Tsukiashi, Kohei Himeda, Takuto Nishimura, Saori Ogawa, Mako Kandabashi, Shu Ishibashi, Haruna Yano, Teisuke Takita, and Kenji Kojima
  • Organizer: RNaseH2022
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Modified uvsY by N-terminal hexahistidine tag addition enhances efficiency of recombinase polymerase amplification to detect SARS-CoV-2 DNA (2022)
  • Author(s): Kevin Maafu Juma, Teisuke Takita, Masaya Yamagata, Mika Ishitani, Kaichi Hayashi, Kenji Kojima, Koichiro Suzuki, Yuri Ando, Wakao Fukuda, Shinsuke Fujiwara, Yukiko Nakura, Itaru Yanagihara, Kiyoshi Yasukawa
  • Organizer: 第95回日本生化学会大会
• [Presentation] 耐熱性ヘリカーゼと一本鎖 DNA 結合タンパク質を用いた等温核酸増幅技術の開発 (2022)
  • Author(s): 安藤友理、村上雄人、福田青郎、藤原伸介
  • Organizer: 日本Archaea研究会第34回講演会（九州大学・西新プラザ）
• [Presentation] 耐熱性DNAポリメラーゼの鎖置換に関与する領域の比較解析 (2022)
  • Author(s): 井上瑛介、Kevin Maafu Juma、滝田禎亮、保川清、柳原格、藤原伸介, 福田青郎.
  • Organizer: 第95回日本生化学会大会