2022 Fiscal Year Annual Research Report
Toxicity assessment and identification of contributing chemicals by simultaneous determination of oxidative and electrophilic stress derived from airborne particulate matters
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22H03761
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Nagasaki University |
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Principal Investigator |
鳥羽 陽 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(薬学系), 教授 (50313680)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
畑 光彦 金沢大学, 地球社会基盤学系, 教授 (00334756)
長谷井 友尋 大阪医科薬科大学, 薬学部, 准教授 (10388027)
古内 正美 金沢大学, 地球社会基盤学系, 教授 (70165463)
唐 寧 金沢大学, 環日本海域環境研究センター, 教授 (90372490)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 大気粒子 / 活性酸素 / 酸化ストレス / 付加体生成 / 求電子ストレス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
微小粒子状物質（PM2.5）と各種疾患との関係が疫学研究により確認され，様々な毒性を有する物質が測定されているが，複合的な健康影響を特定成分から評価することは困難である。大気粒子（PM）の健康リスク指標として用いられている活性酸素（ROS）産生能（酸化能）に関する現行手法は原理的に「ROS産生（酸化ストレス）」と「求電子的な不可逆的反応による付加体生成（親電子性ストレス）」を区別せずに評価している。本研究では，PMの健康リスク指標として，ROS産生（酸化ストレス）と求電子的な不可逆的反応による付加体生成（親電子性ストレス）とを区別して評価できる簡便で高感度な新規アッセイ法を開発し，PM試料の両活性の変動評価を行い，代謝により生体内で起こり得る毒性の増強評価や活性寄与物質の同定を行うことを目的とする。
令和4年度は，高感度な新規蛍光アッセイを確立するため，酸化能（ROS産生能）の測定法と付加体生成能の測定法の開発を実施した。酸化能の測定では，ROS産生能の高いモデル化合物を用いてアッセイの新たな基質として(2S)-2-amino-1,4-dimercaptobutane（DTBA）を検証し，試験物質との反応後に生成する基質酸化体を蛍光誘導体化して測定することで酸化体生成量（ROS産生能）を算出する，高感度アッセイを開発することに成功した。また，ROSによる酸化体生成と付加体の生成による2つの基質消費を同時に評価することを目的として，従来のアッセイ法を改良し，アッセイの過程で残存する基質をベンジルマレイミド化して検出し，基質酸化体も同時に検出することができた。生成した基質酸化体量と残存基質量の測定により，モデル化合物の酸化能の評価を行ったところ，基質消費に対するROSと付加体生成の寄与について，付加体に比べてROS産生の寄与が大きいことが分かった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究計画どおりにROS産生（酸化ストレス）を測定するための高感度な新規蛍光アッセイを確立することに成功した。さらに，ROS産生と求電子的な不可逆的反応による付加体生成（親電子性ストレス）とを区別して評価できる簡便な新規アッセイ法を開発した。一方，ROS蛍光アッセイ法では，基質が自動酸化されやすく，ブランク操作での基質消費が存在したためにバックグラウンド蛍光が問題となった。また，ROS産生物質と付加体生成物質とが混在する環境試料の場合，ROS産生に基づく基質の酸化によるシグナルの中に付加体生成が埋没してしまい，実質的にはROS産生能しか評価できない可能性があるため，基質の自動酸化の防止や付加体生成の効率的な検出が必要である。
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| Strategy for Future Research Activity |
高感度化した蛍光アッセイの開発に成功したものの，バックグラウンドの基質消費により個人サンプラで捕集した微量な大気試料等についてアッセイを実施するのは困難であり，アッセイのバックグラウンドを低下させるためのさらなる検討を行う。また，従来の基質を参考にしてジチオール体の物質をアッセイの基質として検証してきたが，基質の自動酸化や，ROS産生による基質酸化のシグナルが付加体生成よりも著しく大きくなり，付加体の評価を同時に行うことが難しいことが問題点として挙げられた。以上のことから，生体のタンパク質の構造に近い低分子チオールや血清アルブミンのシステイン残基のようなモノチオールを基質とするアッセイの開発も実施する予定である。
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