2013 Fiscal Year Annual Research Report
革新的高輝度近赤外発光プローブの創製と生体内癌イメージングへの応用
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24225001
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
鈴木 孝治 慶應義塾大学, 理工学部, 教授 (80154540)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
佐藤 守俊 東京大学, 総合文化研究科, 准教授 (00323501)
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| Project Period (FY) |
2012-05-31 – 2017-03-31
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| Keywords | バイオケミカルセンサー / 生物発光 / イメージングプローブ / ルシフェリン / ルシフェラーゼ |
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| Research Abstract |
今年度は、発光基質であるセレンテラジンの6位および8位の炭素を置換あるいは共役系で拡張した分子を設計・合成し、それらの分子構造と発光特性の構造相関を詳しく調べた。その結果、6位の炭素から基質分子骨格を拡張した分子とルシフェリン変異体を使用すると、天然のセレンテラジン生物発光系の発光量と同程度の発光量を示す結果を得た。
一方、ホタルルシフェリンにおいては、酸化発光部位であるチアゾリン環に合成蛍光色素を直結させた新規の生物発光基質を２種設計、合成したところ、天然のホタルルシフェリンの水酸基の位置においてだけ、分子を拡張しても発光するという結果になった。どちらのルシフェリンも天然のルシフェラーゼを使うと発光条件に限界があるが、ルシフェラーゼ変異体を用いると、発光特性が異なることが観察された。このことはルシフェリンもルシフェラーゼも両方を変化させる必要があり、そのマッチが重要であることを示している。これにより、本研究の意義が実験的に証明されたことになる。
合成したホタルルシフェリンの誘導体２種については、さまざまな生物種由来のルシフェラーゼに対する選択性を調べた。天然のホタルルシフェリンは、種々の生物種由来のルシフェラーゼに対して幅広く認識されて生物発光を生起するが、当該合成ルシフェリン２種はそれぞれ特定のルシフェラーゼに選択的に認識され生物発光を生起することを明らかにした。また、カイアシ類が分泌するルシフェラーゼの機能を探索したところ、同ルシフェラーゼがジスルフィド結合依存的に生物発光活性を獲得していることを明らかにした。さらに、このカイアシ類のルシフェラーゼに改変を加えることにより、細胞に対する化合物ストレスや紫外線ストレスによって生じた活性酸素種を検出する新たな生物発光センサーの開発に成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
生物発光基質であるセレンテラジンの6位および8位の炭素を置換あるいは共役系で拡張した分子を設計・合成し、分子構造と発光特性の構造相関を詳しく調べた結果、6位の炭素から基質分子骨格を拡張した分子とルシフェリン変異体を使用すると生物発光を示した。過去のセレンテラジン誘導体合成物の殆どが構造改変のため酵素認識されず生物発光を示さないのに対して、本研究で開発した新規基質は、既存の酵素に認識を受け、かつ高輝度な発光を示した価値は大きい。特にセレンテラジンの6位炭素にスチレン基を結合させて共役を拡張させた新規誘導体は、ルシフェラーゼ改変体において高輝度の発光(435nm)を示し、発光量は類似した波長域で発光を示す市販のセレンテラジン誘導体(Deep Blue C)と比べて約20倍の発光強度を示した。この結果は平成26年3月に米国シカゴで行われた国際会議（Pittcon 2014）で発表を行い、国際誌への投稿論文を準備中である。
一方、ホタルルシフェリンにおいては、酸化発光部位であるチアゾリン環に合成蛍光色素を直結させた新規の生物発光基質を２種について、それぞれ特定のルシフェラーゼに選択的に認識され生物発光を生起することを明らかにした。また、カイアシ類が分泌するルシフェラーゼの機能を探索したところ、ジスルフィド結合依存的に生物発光活性を獲得していることを明らかにした。さらに、このカイアシ類のルシフェラーゼに改変を加えることにより、細胞に対する化合物ストレスや紫外線ストレスによって生じた活性酸素種を検出する新たな生物発光センサーの開発に成功したことは大きな進展である。
このように、セレンテラジンおよびホタルの両基質における分子拡張のブレークスルー、およびルシフェラーゼに改変での新たな発光センサー開発の成功は、本研究の順調な進展を示すものである。
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| Strategy for Future Research Activity |
新規生物発光基質の開発においては、これまでに、天然の基質であるセレンテラジン(CTZ)分子の6位の炭素を置換あるいは共役系で拡張した分子を設計し、最も有用である結果を得たため、今後はこの6位へさまざまな置換基導入および色素導入を行うことで、天然基質のCTZの発光波長を変化させる。一方、ホタルルシフェリンにおいては、チアゾリン環に色素を直結させた後に、さらに色素を導入する新規の生物発光基質を設計合成する。その際、さまざまな置換基を拡張分子末端に導入することで発光波長の制御を検討する。
一方、ルシフェラーゼへの変異導入と変異体の構築においては、昨年度に得られたセレンテラジンの6位の炭素を置換あるいは共役系で拡張した合成基質を使用して、近赤外領域(650 nm以上)の生物発光を示す新たな酵素（ルシフェラーゼ）の変異体作製を行う。昨年度の合成基質に対して、特異的な生物発光シグナルを生起するルシフェラーゼ変異体を同定したため、本年度はこのルシフェラーゼ変異体に近赤外蛍光タンパク質を連結することにより、生物発光共鳴エネルギー移動（BRET）に基づいて、生物発光シグナルの大幅な長波長化を実現する。特に、最適な近赤外蛍光タンパク質の探索と両タンパク質の連結部のアミノ酸配列、リンカー配列の最適化等の詳細な検討により、長波長かつ高輝度化を目指す。また、ルシフェラーゼに対する選択的応答が明らかになったホタルルシフェリンの誘導体については、マウス生体でのin vivoイメージングを行う。同様に、昨年度までに開発した活性酸素種の生物発光センサーについて、さらなる高輝度化を検討する。
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