2015 Fiscal Year Annual Research Report
革新的高輝度近赤外発光プローブの創製と生体内癌イメージングへの応用
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24225001
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
鈴木 孝治 慶應義塾大学, 理工学部, 教授 (80154540)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
佐藤 守俊 東京大学, 総合文化研究科, 准教授 (00323501)
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| Project Period (FY) |
2012-05-31 – 2017-03-31
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| Keywords | バイオケミカルセンサー / 生物発光 / イメージングプローブ / ルシフェリン / ルシフェラーゼ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１）新規生物発光基質の開発
セレンテラジン(CTZ)6位にアルキル化を施すことで、発光基質と発光酵素の構造活性相関を検討し、高輝度生物発光システムの構築を目指した。なお、生物発光特性評価においては酵素Rlucとその変異体、並びにCTZを発光基質とする酵素として、産総研の金博士の開発した高輝度を持つ人工発光酵素のAlucを用いた。開発したアルキル化CTZ誘導体の１つにおいて、Alucにおける発光輝度は、天然のCTZ・Aluc発光系の約4倍及びCTZ・Rluc発光系の約60倍と非常に高輝度であることが分かった。従って、極めて高輝度な人工生物発光システムの開発に成功したと言える。また、セレンテラジン(CTZ)については、6位により長波長領域に蛍光を示す有機蛍光色素を修飾し、生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)現象を利用することで生物発光の近赤外化を試みた。CTZ6位に蛍光色素を結合したBRET型誘導体の生物発光酵素(Rluc, Rluc8, Rluc8.6)並びに人工発光酵素Alucとの反応性をそれぞれ調べた。BRET型CTZ誘導体は、CTZ の発光波長に適合する蛍光色素にはBRET蛍光発光することが確認された。
２）ルシフェラーゼ変異体の開発
D-ルシフェリンの誘導化に基づいて、開発したアリルルシフェリンおよび合成基質(アカルミネ)について、さまざまな生物発光種由来のルシフェラーゼとの反応性に関する生物発光評価を行った。この検討の結果、アカルミネ(最大発光波長 : 680 nm)とアリルルシフェリン(最大発光波長 :580 nm)にそれぞれ特異的に反応するルシフェラーゼ(以下, “Luc-680”と”Luc580”とする)を発見した。この結果を受けて、新規アリルルシフェリンを設計・合成中であるが、現在680nmまでの長波長化までの目処がついた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
セレンテラジン(CTZ)6位をアルキル化したCTZ誘導体の合成を多数行ったところ、CTZ誘導体の１つにおいて、Alucにおける発光輝度は天然のCTZ・Aluc発光系の約4倍及びCTZ・Rluc発光系の約60倍と非常に高輝度であり、世界で最も高輝度な人工生物発光システムの開発に成功した（論文投稿準備中）。今後、in vivoでの実用性を検討する。同時に高輝度化に関して、CTZ・Aluc発光系で多数の多価金属イオン存在下での生物発光特性評価を行った結果、Ca2+, Mg2+, Cr6+などを添加すると生物発光輝度が増加しすることが分かり、特にCa2+添加で強い発光効果があることを見出した。
また、CTZ6位に蛍光色素を結合した新規BRET型誘導体を開発したところ、Rlucの変異体のRluc8.6に効率良く認識を受け、天然のRluc発光系と同様の発光輝度を保ちながら約40 nmの長波長化を示した。また、Alucにおいても酵素認識を受け、その発光輝度はRluc8.6の約4倍とより高輝度な生物発光を示した。CTZの高輝度BRET基質はこれまでにはなく、新たな生物発光系の長波長化の指針になる。
変異酵素については、D-ルシフェリンの誘導化アカルミネ(最大発光波長 : 680 nm)とアリルルシフェリン(最大発光波長 :580 nm)にそれぞれ特異的に反応するルシフェラーゼ(以下, “Luc-680”と”Luc580”とする)を発見した。ホタル発光系の高輝度化に貢献する成果である。この結果からアリルルシフェリンの構造と変異酵素との立体構造相関を検討しているが、現在680nmまでの長波長化ができる結果を得ている。
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| Strategy for Future Research Activity |
近赤外蛍光タンパク質との融合に基づくアプローチは、研究開発当初は計画していなかったが、これまでの研究で高輝度の青色生物発光システムが実現したことにより、CTZ誘導体ではBRET 型基質を開発することが非常に有望なアプローチの一つと考えるようになった。このアプローチの成功のためには、近赤外蛍光タンパク質の高輝度化、および近赤外蛍光タンパク質と生物発光タンパク質の融合の最適化が鍵を握ると考えている。
CTZ6位改変体が既存の酵素に認識を受ける事が分かったが、酵素認識に重要と部位の解明には未だ至っていない。そこでこれまで酵素認識に関与しないとされてきた部位における置換基導入効果も調べる事で網羅的な構造活性相関研究を行う。また、開発したアルキル化セレンテラジン誘導体は、人工生物発光酵素Alucにおいて非常に高輝度な生物発光輝度を示したが、その原因は未解明である。従ってアルキル末端及びアルキル長さの検討を行い、構造活性相関を行う事で原因の解明を行う。また生物発光評価において重要なファクターとなる物理定数(代謝速度・生物発光量子収率・ミカエリスメンテン定数)の算出も行う。
開発した合成基質(アリルルシフェリン)と生物発光タンパク質(Luc-680とLuc0580)を用いてマウス生体(in vivo)での細胞イメージングの検証を行う。また、開発した合成基質（アリルルシフェリリン）と生物発光タンパク質（Luc-680とLuc-580）を用いて、マウス生体（in vivo）での細胞イメージングの検証を行う。さらに、生物発光タンパク質と蛍光タンパク質の連結を最適化してBRET効率を向上させ、蛍光タンパク質（特にAM1_1557g2）への変異導入を行うことにより、高輝度な近赤外生物発光システムを完成させる。
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