2012 Fiscal Year Annual Research Report
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24227001
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Grant-in-Aid for Scientific Research (S)
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
深田 吉孝 東京大学, 理学(系)研究科(研究院), 教授 (80165258)
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| Project Period (FY) |
2012-10-26 – 2017-03-31
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| Keywords | 体内時計 / サーカディアンリズム / シグナル伝達 / 脳・神経 / 光生物 / 長期記憶 / 転写因子 / 遺伝子改変マウス |
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| Research Abstract |
《1》入力系: 哺乳類の概日光受容は網膜の光感受性神経節細胞ipRGCが担うが、本研究により、ipRGCの光受容蛋白質OPN4が新たなシグナル伝達経路を駆動する可能性が浮かび上がってきた。RNAiを用いた機能阻害実験の結果、三量体G蛋白質の一つのサブタイプがこの新規OPN4シグナル経路に必要であることが示唆された。
《2》脳機能: 記憶効率の概日変動におけるSCOPの重要性を明らかにするため、SCOP-ノックアウト(KO)マウスを作成した。このSCOP-KOマウスを用いて記憶形成効率の時刻依存性を解析したところ、野生型でみられる長期記憶の形成効率の概日変動が消失したが、短期記憶の形成効率はSCOP-KOにより影響されないことを見出した。
《3》分子時計: CRYをユビキチン化して分解に導くF-box型E3リガーゼFbxl3と、これと相同性が高いFbxl21に着目し、そのKOマウスの輪回し行動リズムを解析した。Fbxl3-KOマウスでは行動リズムの周期が著しく延長した。この周期延長効果はFbxl3とFbxl21のダブルKOマウスにおいて緩和されたが、一部のダブルKOマウスは行動リズムが消失するという顕著なリズム異常を示した。機能解析から、FBXL21はCRYをユビキチン化して安定化することを見出した。以上の成果をまとめた論文はCell誌に掲載された。これと並行して、転写因子CLOCKのDNA結合領域を決定するために、自作抗体を用いたChIP-Seq解析を行った。さらに新たなバイオインフォマティクス技術MOCCSを開発し、CLOCKのDNA認識配列を網羅的に抽出した。またRNA-Seqとsmall RNA-Seq解析を行い、CLOCKの時刻特異的なDNA結合が転写リズムを生み出すネットワーク機構を明らかにした。以上の成果をまとめた論文はMol.Cell.Biol.誌に掲載された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
分子時計に関する研究において、CRY蛋白質の安定化制御、およびCLOCKのDNA結合が生み出す転写リズムという、２つのテーマにおいて大きな成果を上げることができた。CRY の安定化に関しては、時計蛋白質CRYをユビキチン化するE3リガーゼFBXL3とFBXL21がCRY蛋白質の安定性を制御する分子機構の解明に取り組んだ。計画通り研究を進め、KOマウスの行動リズム解析や分子生物学的解析から、FBXL3はCRYをユビキチン化して不安定化し、FBXL21はCRYをユビキチン化することにより逆に安定化することを見出した。転写因子CLOCKに関しては、結合領域の情報から分子時計による遺伝子出力の制御を明らかにするため、自作抗体を用いたChIP-Seq解析を行った。さらに新たなバイオインフォマティクス技術MOCCSの開発に成功し、CLOCKのDNA認識配列を網羅的に抽出することができた。またRNA-Seqとsmall RNA-Seq解析を行い、CLOCKの時刻特異的なDNA結合が転写リズムを生み出すネットワーク機構を明らかにした。これら２つの分子時計に関する研究は当初の計画以上に進展し、CRYのユビキチン化に関する成果をまとめた原著論文はCell誌に、CLOCK の結合領域に関する原著論文は、Mol.Cell.Biol.誌に掲載された。
一方、入力系の研究では、OPN4が三量体G蛋白質の一つのサブタイプを活性化し概日光受容の新たなシグナル伝達経路を担うことを示唆できた。
脳機能に関する研究では、SCOP-KOマウスを作成し、記憶形成効率の概日変動への影響を調べる事により、SCOPが概日時計機構と長期記憶形成機構とを繋ぐ因子である可能性を強く示唆する事ができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
入力系：光受容蛋白質OPN4がcAMPの濃度制御を行う可能性があるため、cAMP合成系に関わるGsαサブユニット遺伝子をipRGC選択的に欠失する変異マウスを作製し、ipRGCの光応答解析を行う。また、cAMP合成酵素ACのサブタイプ9種類のうち、ipRGCに発現するサブタイプを同定したい。
脳機能：SCOP が概日時計と記憶機能を結ぶ因子である可能性が示唆されたため、海馬初代培養神経細胞を用いて、記憶形成効率がリズムを示す分子メカニズムの本質に迫る。SCOP が存在するラフトの破壊やSCOP の機能阻害条件下で、細胞刺激に伴うERKとCREBの活性化がどのように影響を受けるのか検討する。また、行動リズムを生み出すニューステロイドとして7αOH-プレグネノロン(7αOH-Preg)に注目している。HPLCを用いたマウス脳内の微量7αOH-Pregの検出系を構築すると共に、関連ニューロステロイドも含めて、広くニューロステロイドの動態に迫りたい。
分子時計：CLOCK-BMAL1複合体がリズミックなDNA結合リズムを生み出す分子基盤に迫るべく 、生化学的な研究を展開する。時計タンパク質と結合する分子をインタラクトーム解析により網羅的に同定する。さらに、時計タンパク質そのものの質量分析データから、新しい翻訳後修飾と修飾部位、ならびにその生理的役割を探りたい。本研究で得られたオミクスデータを切り口に分子時計の振動メカニズムにアプローチする。
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[Journal Article] Identification of non-visual photomotor response cells in the vertebrate hindbrain.2013
Author(s)
David Kokel, Timothy W. Dunn, Misha B. Ahrens, Rudiger Alshut, Chung Yan J. Cheung, Louis Saint-Amant, Giancarlo Bruni, Rita Mateus, Tjakko van Ham, Tomoya Shiraki, Yoshitaka Fukada, Daisuke Kojima, Jing-Ruey J. Yeh, Ralf Mikut, Johannes von Lintig, Florian Engert and Randall Peterson.
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Journal Title
J. Neurosci.
Volume: 33
Pages: 3834-3843
DOI
Peer Reviewed
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[Presentation] CLOCK-ChIP-Seq and Circadian Transcriptome in the Mouse Liver.
Author(s)
Hideki Terajima, Hikari Yoshitane, Haruka Ozaki, Ngoc-Hien Du, Yutaka Suzuki, Shigeki Shimba, Taihei Fujimori, Sumio Sugano, Toshihisa Takagi, Wataru Iwasaki, and Yoshitaka Fukada
Organizer
第86回日本生化学会大会
Place of Presentation
パシフィコ横浜（神奈川県）
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