メダカを用いた体細胞遺伝学：体組織レベルでの損傷応答機構解析系の確立

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 24241018
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 藤堂 剛 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (90163948)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 木下 政人 京都大学, (連合)農学研究科(研究院), 助教 (60263125)
• Project Period (FY): 2012-05-31 – 2015-03-31
• Keywords: メダカ / DNA損傷 / 損傷応答

Outline of Annual Research Achievements

DNA損傷応答研究における今後の課題は、細胞レベルで明らかにされてきた損傷応答機構が、実際の個体内（体組織レベル）でどのように制御され，発がん等生体影響につながっているのかを明らかにする事である。本申請では、メダカにおいてDNA損傷応答を体組織レベルで解析する系の樹立を目指す。既に作製している損傷応答のキープロセスに関わる主要遺伝子のメダカ変異体を基盤に、Transgenic (TG)個体あるいはトランスポゾンベクターにより体細胞モザイクをを作製し、遺伝子機能解析系を構築するのが基本戦略である。本年度は以下の事を実施した。
１）変異体の利用：樹立している損傷応答遺伝子変異体についての表現型チェックを行うとともに、昨年度に引き続きこれ等変異の透明メダカ系統STIIへの導入を行った。
２）体細胞モザイクの作成：体細胞モザイク作成は，①piggyBac(PB)トランスポゾンベクターによる体細胞への高効率遺伝子導入法、②赤外レーザによる局所的遺伝子発現誘導系の２方法により行う。①昨年度来、PBベクターを用いたBACクローン遺伝子導入法の開発を行っている。この手法開発上の問題点は、Recombineering(RN) によるBAC クローン操作の効率の悪さ、ベクター内のinsertの安定性の悪さ、極めて長いゲノム領域(>30kb) のベクターへの導入の困難さ、である。 今年度は i) RN の効率を上げる, ii) 30kb以上の長さのinsertをPBベクターに組み込む手法の開発によりこれ等問題点の解決を行なった。②昨年来、メダカ体細胞においてCre/loxPによるゲノム編集をヒートショックで制御する系の樹立を行なっている。最大の問題点は、非照射細胞でもCreが発現してしまうバックグラウンド(BG)の存在である。本年度は、この低減化を目指した。樹立した複数個のTGラインをスクリーニングし、低BGのラインを選別するとともに、BG細胞を特異的に除去する手法の開発を行なった。

Research Progress Status

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] p53-Dependent Suppression of Genome Instability in Germ Cells. (2014)
  • Author(s): Otozai S, Ishikawa-Fujiwara T, Oda, S, Kamei Y, Ryo H, Sato A, Nomura T, Mitani H, Tsujimura T, Inohara H, and Todo T
  • Journal Title: Mutat Res. Volume: 760 Pages: 24-32
  • DOI: 10.1016/j.mrfmmm.2013.12.004
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] The Cryptochrome/Photolyase Family in aquatic organisms. (2014)
  • Author(s): Oliveri P, Fortunato AE, Petrone L, Ishikawa-Fujiwara T, Kobayashi Y, Todo T, Antonova O, Arboleda E, Zantke J, Tessmar-Raible K, Falciatore A.
  • Journal Title: Mar Genomics Volume: 14 Pages: 23-37
  • DOI: 10.1016/j.margen.2014.02.001.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Human papillomavirus and p53 mutations in head and neck squamous cell carcinoma among Japanese population. (2014)
  • Author(s): Maruyama H, Yasui T, Ishikawa-Fujiwara T, Morii E, Yamamoto Y, Yoshii T, Takenaka Y, Nakahara S, Todo T, Hongyo T, Inohara H.
  • Journal Title: Cancer Sci. Volume: 105 Pages: 409-417
  • DOI: 10.1111/cas.12369.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Imaging plant leaves to determine changes in radioactive contamination status in Fukushima, Japan. (2014)
  • Author(s): Nakajima H, Fujiwara M, Tanihata I, Saito T, Matsuda N, Todo T.
  • Journal Title: Health Phys. Volume: 106 Pages: 565-570
  • DOI: 10.1097/HP.0000000000000020.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A Novel Protein, CHRONO, Functions as a Core Component of the Mammalian Circadian Clock. (2014)
  • Author(s): Akihiro Goriki, Fumiyuki Hatanaka, Jihwan Myung, Jae Kyoung Kim, Takashi Yoritaka, Shintaro Tanoue, Takaya Abe, Hiroshi Kiyonari, Katsumi Fujimoto, Yukio Kato, Takashi Todo, Akio Matsubara, Daniel Forger, Toru Takumi,
  • Journal Title: PLoS Biol. Volume: 12 Pages: e1001839
  • DOI: 10.1371/journal.pbio.1001839.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Human papillomavirus and cystic node metastasis in oropharyyngeal cancer and cancer of unknown primary origin. (2014)
  • Author(s): Yasui T, Morii E, Yamamoto Y, Yoshii T, Takenaka Y, Nakahara S, Todo T, Inohara H.
  • Journal Title: PLoS One. Volume: 9 Pages: e95364
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0095364.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] A Positive Role for PERIOD in Mammalian Circadian Gene Expression. (2014)
  • Author(s): Akashi M, Okamoto A, Tsuchiya Y, Todo T, Nishida E, Node K.
  • Journal Title: Cell Rep. Volume: 7 Pages: 1056-1064
  • DOI: 10.1016/j.celrep.2014.03.072.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Loss of follicle-stimulating hormone receptor function causes masculinization and sippression of ovarian development in genetically female medaka. (2014)
  • Author(s): Murozumi N, Nakashima R, Hirai T, Kamei Y, Ishikawa-Fujiwara T, Todo T, Kitano T.
  • Journal Title: Endocrinology. Volume: 155 Pages: 3136-3145
  • DOI: 10.1210/en.2013-2060.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] In vivo role of phosphorylation of cryptochrome 2 in the mouse circadian clock. (2014)
  • Author(s): Hirano A, Kurabayashi N, Nakagawa T, Shioi G, Todo T, Hirota T, Fukada Y.
  • Journal Title: Mol. Cell. Biol. Volume: 34 Pages: 4464-4473
  • DOI: 10.1128/MCB.00711-14.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Molecular mechanism of mutagenesis in Medaka fish (2015)
  • Author(s): Tomoko Ishikawa-Fujiwara, Yoshihiro Fujikawa, Eri Shiraishi, Takeshi Todo
  • Organizer: International Symposium on Genome Science 2015
  • Place of Presentation: 東京 一橋ホール
  • Year and Date: 2015-01-20 – 2015-01-21
• [Presentation] TALENs によるメダカにおける TLS ポリメラーゼ遺伝子群変異体の網羅的作製 (2014)
  • Author(s): 藤川芳宏、藤原（石川）智子、佐久間哲史、山本卓、藤堂 剛
  • Organizer: 第57回日本放射線影響学会
  • Place of Presentation: かごしま文化センター
  • Year and Date: 2014-10-01 – 2014-10-03
• [Presentation] CRISPR/Cas9システムによるメダカ光回復酵素遺伝子変異体の樹立 (2014)
  • Author(s): 藤原（石川）智子、藤川芳宏、藤堂 剛
  • Organizer: 第57回日本放射線影響学会
  • Place of Presentation: かごしま文化センター
  • Year and Date: 2014-10-01 – 2014-10-03
• [Presentation] メダカ生殖細胞における放射線誘発遺伝的不安定性の解析 (2014)
  • Author(s): 藤原（石川） 智子、音在 信治、尾田 正二、三谷 啓志、猪原 秀典、藤堂 剛
  • Organizer: 第57回日本放射線影響学会
  • Place of Presentation: かごしま文化センター
  • Year and Date: 2014-10-01 – 2014-10-03
• [Presentation] CRISPR/Cas9システムによるメダカ光回復酵素遺伝子変異体の樹立 (2014)
  • Author(s): 藤原（石川）智子、藤川芳宏、藤堂 剛
  • Organizer: 第36回光医学光生物学会
  • Place of Presentation: 大阪大学 銀杏会館
  • Year and Date: 2014-07-25 – 2014-07-26
• [Presentation] TALENsを利用した遺伝子破壊によるメダカの損傷乗り越えDNA合成ポリメラーゼ遺伝子変異体の作成 (2014)
  • Author(s): 藤川芳宏、藤原（石川）智子、藤堂 剛
  • Organizer: 第36回光医学光生物学会
  • Place of Presentation: 大阪大学 銀杏会館
  • Year and Date: 2014-07-25 – 2014-07-26