ＣＮＴを応用した高機能生体材料創製のためのＣＮＴ・生体界面技術の構築と安全性評価

2012 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 24241045
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
• Research Institution: Shinshu University
• Principal Investigator: 齋藤 直人 信州大学, 医学部, 教授 (80283258)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 加藤 博之 信州大学, 医学部, 教授 (40204490) ; 佐々木 克典 信州大学, 医学部, 教授 (30170666) ; 樽田 誠一 信州大学, 工学部, 教授 (00217209) ; 宇田川 信之 松本歯科大学, 歯学部, 教授 (70245801) ; KIM YOONG AHM 信州大学, 工学部, 准教授 (70362100)
• Project Period (FY): 2012-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: カーボンナノチューブ / 生体材料 / 生体界面 / 生体安全性

Research Abstract

CNT材料の開発研究として、本研究に使用するCNTの化学修飾およびCNTと生体材料の複合化を行った。これらのCNT材料表面における基本的生体反応を、CNT材料表面へのタンパク質の吸着、細胞接着、血栓形成、補体系活性化などで検討した。 皮下組織界面の研究として、CNT材料を実験動物の皮下に埋め込み、経時的に周囲組織とともに摘出して、炎症などの生体反応を観察した。硬組織界面の研究では、CNT材料を実験動物の硬組織に埋め込み、その界面を形態学的に観察し、硬組織形成能やCNT含有硬組織の特性を調べた。CNTが骨形成能を促進するメカニズムを解明するために、骨芽細胞、軟骨細胞、破骨細胞に接触して生じるCNTの挙動と作用を微細構造学的に解析し、CNTが石灰化の核となる知見を得ており、CNTの骨基質内への取り込み過程を石灰化機構と関連づけて検討した。CNTと細胞の界面については、１本のCNTを１個の細胞に作用させる技術開発を進めた。この新手法を用いて、細胞へのCNTの作用、細胞内でのCNTの挙動、CNTが突き刺さった細胞の変化などを観察した。細胞毒性の研究において、CNT材料を生体外で培養線維芽細胞に作用させ、分化・増殖・取り込み・サイトカイン産生などの細胞反応を評価した。発癌性試験として、遺伝子改変発癌性マウス（rasH2）へのCNT材料の埋め込み試験を行った。また、AMES試験、Comet Assayなどで、突然変異誘発性の評価を行った。生体内動態の研究として、CNT材料に微細な金を付加する技術を開発した。さらに、CNT材料をES細胞に作用させ、幹細胞の反応を検討した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

生体に適した特性を有するCNTや、他材料との複合に適したCNTの開発を行い、生体組織や細胞界面の研究結果をフィードバックして、さらに有用なCNT材料の開発を進めることができた。皮下組織界面の研究では、CNT材料は短・中期評価で強い炎症反応を惹起せず、マクロファージに取り込まれることを明らかにした。硬組織界面の研究では、CNT材料が骨形成能を促進するメカニズムを解明し、骨芽細胞、軟骨細胞、破骨細胞に接触して生じるCNTの挙動と作用を微細構造学的に解析できた。また、CNT材料を取り込んだ硬組織の特性ならびにCNT材料と基質との界面について超微細構造学的な検討を行った。細胞界面の研究のために、CNT１本１本をガラス板上で分離し、顕微鏡下に培養細胞の培養液に注入する世界初の技術開発を進め、細胞形態の変化、細胞内小器官の変化、CNTの存在部位、CNTの細胞膜への作用などを評価した。接着性細胞である繊維芽細胞や内皮細胞がCNT材料表面に接着する様式を分析し、表面に吸着したタンパクを介して材料の情報が細胞へ伝達され、誘導される反応の解析にまで踏み込んだ。細胞毒性の研究では、CNT材料が高度な細胞毒性を示さないことを明らかにした。遺伝子改変発癌性マウス（rasH2）を用いた、発癌性評価技術を構築し、CNT材料によって発癌しないことを確認した。生体内動態の研究では、CNTに微細な金を付加する技術を開発した。ES細胞を用いて、幹細胞による再生医療の課題である培養技術、分化誘導、組織構築などに対するCNT材料の影響を検討できた。以上より、概ね本年度の研究計画は達成できたと考える。

Strategy for Future Research Activity

平成24年度に引き続き、平成25年度もCNT材料開発および複合技術開発を信州大学工学部・カーボン科学研究所が行う。得られた材料を、信州大学医学部と松本歯科大学において密に連携を保ちながら、生体組織や細胞との界面に着目して研究を進めていく。この際、それぞれの専門的知識と実験手技を動員・統合して、横断的な新知見を獲得する。得られた結果は随時工学にフィードバックし、生体との界面を制御する高機能生体材料を開発していく。実用化に最も重要な生体安全性は、平成24年度同様にCNT・生体界面研究の結果を反映させて評価を実施する。研究計画の最終的なゴールは、CNTの癌治療に用いるDDS、温熱療法、イメージング等への応用、再生医療に用いるscaffold への応用、外科用インプラントへの応用等のための確固たる基盤技術を構築することである。さらに、CNTの生体材料としての国際的な安全性評価基準を構築して、臨床応用の実現を目指す。平成24年度からの継続研究内容：(1)CNT材料の開発研究　(2)CNT材料表面における基本的生体反応の研究　(3)皮下組織界面の研究　(4)硬組織界面の研究　(5)細胞界面の研究　(6)細胞毒性の研究　(7)発癌性試験　(8)生体内動態の研究　(9)iPS 細胞・ES 細胞の研究　(10)卵細胞の研究。平成25年度から開始する研究内容：(11)酸化ストレス誘導の研究　(12)細胞表面接着の研究　(13)硬組織関連細胞界面の研究　(14)マクロファージ界面の研究 (15)血管・神経の研究　(16)抗菌性研究　(17)遺伝子治療研究　(18)DDSに応用する研究　(19)電磁波による癌の温熱療法研究　(20)組織再生のためのscaffold に応用する研究　(21)生体安全基準の構築　(22)革新的生体材料の創製。

Research Products

• [Journal Article] Culture medium type affects endocytosis of multi-walled carbon nanotubes in BEAS-2B cells and subsequent biological response (2013)
  • Author(s): Haniu H, Saito N, Matsuda Y, Tsukahara T, Maruyama K, Usui Y, Aoki K, Takanashi S, Kobayashi S, Nomura H, Okamoto M, Shimizu M, Kato H
  • Journal Title: Toxicol in Vitro Volume: 27 Pages: 1679-1685
  • DOI: 10.1016/j.tiv.2013.04.012.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] カーボンナノチューブの生体材料への応用―カーボンナノチューブと骨組織の親和性― (2013)
  • Author(s): 青木薫, 齋藤直人
  • Journal Title: 研究開発リーダー Volume: 印刷中 Pages: 印刷中
• [Journal Article] Carcinogenicity evaluation for the application of carbon nanotubes as biomaterials in rasH2 mice (2012)
  • Author(s): Takanashi S, Hara K, Aoki K, Usui Y, Shimizu M, Haniu H, Ogihara N, Ishigaki N, Nakamura K, Okamoto M, Kobayashi S, Kato H, Sano K, Nishimura N, Tsutsumi H, Machida K Saito N
  • Journal Title: Sci Rep Volume: 2 Pages: 498
  • DOI: 10.1038/srep00498
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Microstructure development and fracture toughness of acid-treated carbon nanofibers/alumina composites (2012)
  • Author(s): Ueda N, Yamakami T, Yamaguchi T, Kitajima K, Usui Y, Aoki K, Endo M, Saito N, Taruta S
  • Journal Title: J Ceram Soc Jpn Volume: 120 Pages: 560-568
  • Peer Reviewed
• [Presentation] カーボンナノファイバー/アルミナ複合体の微細構造および破壊靱性に与えるカーボンナノファイバー添加量の影響 (2013)
  • Author(s): 植田直樹, 山上朋彦, 山口朋浩, 遠藤守信, 齋藤直人, 樽田誠一
  • Organizer: 日本セラミックス協会2013年年会
  • Place of Presentation: 東京
  • Year and Date: 20130317-20130319
• [Presentation] ROS evaluation for series of cnts using the esr method and the effects of cnt mophology (2013)
  • Author(s): Tsuruoka S, Takeuchi K, Koyama K, Endo M, Fujisawa K, Tristan F, Terrones M, Matsumoto H, Saito N, Usui Y, Porter DW, Castranova V
  • Organizer: TechConnect World Conference and Expo 2013
  • Place of Presentation: Washington DC
  • Year and Date: 20130312-20130316
• [Presentation] ROS evaluation for series of cnts using esr method and its cnt concentration effects (2013)
  • Author(s): Tsuruoka S, Takeuchi K, Koyama K, Endo M, Fujisawa K, Tristan F, Terrones M, Matsumoto H, Saito N, Usui Y, Porter DW, Castranova V
  • Organizer: The 52nd Annual Meeting of the Society of Toxicology
  • Place of Presentation: Texas
  • Year and Date: 20130310-20130314
• [Presentation] ROS evaluation for a series of cnts and their derivatives using esr method with dmpo. International Conference on Safe production and use of nanomaterials (2012)
  • Author(s): Tsuruoka S, Takeuchi K, Koyama K, Endo M, Matsumoto H, Saito N, Usui Y, Porter DW, Castranova V
  • Organizer: Nanosafe 2012
  • Place of Presentation: Grenoble
  • Year and Date: 20121113-20121115
• [Presentation] カーボンナノチューブ複合超高分子量ポリエチレンの機械的特性と骨組織親和性 (2012)
  • Author(s): 青木薫, 荻原伸英, 石垣範雄, 中村恒一, 清水政幸, 薄井雄企, 加藤博之, 齋藤直人
  • Organizer: 第27回日本整形外科学会基礎学術集会
  • Place of Presentation: 名古屋
  • Year and Date: 20121026-20121027
• [Presentation] Peapod-CNTによるカーボンナノチューブの体内動態評価方法の開発 (2012)
  • Author(s): 小林伸輔, 高梨誠司, 羽二生久夫, 岡本正則, 清水政幸, 荻原伸英, 石垣範雄, 中村恒一, 加藤博之, 薄井雄企, 齋藤直人
  • Organizer: 第27回日本整形外科学会基礎学術集会
  • Place of Presentation: 名古屋
  • Year and Date: 20121026-20121027
• [Presentation] カーボンナノチューブは骨芽細胞との双方向性の相互作用により骨の石灰化を促進する (2012)
  • Author(s): 清水政幸, 青木薫, 成田伸代, 原一生, 羽二生久夫, 岡本正則, 高梨誠司, 加藤博之, 小林泰浩, 中村浩彰, 川原一郎, 宇田川信之, 高橋直之, 小澤英浩, 薄井雄企, 齋藤直人
  • Organizer: 第27回日本整形外科学会基礎学術集会
  • Place of Presentation: 名古屋
  • Year and Date: 20121026-20121027
• [Presentation] カーボンナノチューブに対する細胞反応の定量的評価法の開発: ONE TO ONE法 (2012)
  • Author(s): 高梨誠司, 羽二生久夫, 石垣範雄, 荻原伸英, 青木薫, 清水政幸, 岡本正則, 小林伸輔, 野村博紀, 加藤博之, 薄井雄企, 齋藤直人
  • Organizer: 第27回日本整形外科学会基礎学術集会
  • Place of Presentation: 名古屋
  • Year and Date: 20121026-20121027
• [Presentation] MWCNTを用いた人工関節部材の開発: 高耐久性部材を中心として (2012)
  • Author(s): 西村直之, 綱島義貴, 井上俊之, 薄井雄企, 齋藤直人
  • Organizer: ナノメディシンフォーラム
  • Place of Presentation: 滋賀
  • Year and Date: 20121019-20121020
  • Invited
• [Presentation] Mechanical property and bone tissue compatibility of MWCNT (multi-walled carbon nanotube)-polyethylene complex (2012)
  • Author(s): Aoki K, Ogihara N, Ishigaki N, Nakamura K, Shimizu M, Haniu H, Kato H, Usui Y, Nishi K, Noguchi T, Nishimura N, Saito N
  • Organizer: 6th International Conference on Nanotoxicology
  • Place of Presentation: Beijing
  • Year and Date: 20120904-20120907
• [Presentation] Estimation of microstructure development of CNTs/alumina composites by electrical conductivity measurement (2012)
  • Author(s): Ueda N, Yamakami T, Yamaguchi T, Endo M, Saito N, Taruta S
  • Organizer: 4th International Congress on Cwramics
  • Place of Presentation: Chicago
  • Year and Date: 20120715-20120719
• [Presentation] ナノカーボン複合 UHMWPEの機械的性質 (2012)
  • Author(s): 貞森和馬, 桜本逸男, 綱嶋義貴, 西村直之, 蔵本孝一, 齋藤直人
  • Organizer: 日本実験力学会2012
  • Place of Presentation: 豊橋
  • Year and Date: 20120714-20120715
• [Presentation] カーボンナノチューブを複合した新規アルミナセラミックスの開発 (2012)
  • Author(s): 齋藤直人, 荻原伸英, 樽田誠一,薄井雄企, 加藤博之, 西村直之
  • Organizer: 第118回中部日本整形外科災害外科学会
  • Place of Presentation: 大阪
  • Year and Date: 20120406-20120407
• [Presentation] Study of the manufacturing process of multi-walled carbon nanotubes for improving biocompatibility
  • Author(s): Haniu H, Saito N, Matsuda Y, Usui Y, Takanashi S, Kobayashi S, Okamoto M, Shimizu M, Ogihara N, Ishigaki N, Nakamura K, Kato H.
  • Organizer: The 6th International Congress of Asian Society of Toxicology
  • Place of Presentation: Sendai
• [Presentation] CNT’s physicochemical properties & safety for applications
  • Author(s): Tsuruoka S, Saito N, Usui Y, Koyama K, Takeuchi K
  • Organizer: The 2nd Symposium on Carbon Nanoforms, jointed with the 6th Annual Meeting of Nano Biomedical Soc
  • Place of Presentation: Tsukuba
  • Invited
• [Presentation] カーボンナノチューブの細胞毒性：形とタイプの影響
  • Author(s): 羽二生久夫, 齋藤直人, 松田佳和, 薄井雄企, 高梨誠司, 小林伸輔, 岡本正則, 清水政幸, 荻原伸英, 石垣範雄, 中村恒一, 加藤博之
  • Organizer: 第39回日本毒性学会
  • Place of Presentation: 仙台
• [Presentation] プロテオミクスを使ったカーボンナノチューブの物性評価
  • Author(s): 羽二生久夫, 齋藤直人, 松田佳和, 石川えり, 薄井雄企, 青木薫, 高梨誠司, 小林伸輔, 岡本正則, 加藤博之
  • Organizer: 日本プロテオーム学会2012年大会
  • Place of Presentation: 東京
• [Presentation] カーボンナノチューブをモデルにした個の安全性評価の検討
  • Author(s): 羽二生久夫, 齋藤直人, 松田佳和, 石川えり, 薄井雄企, 青木薫, 高梨誠司, 小林伸輔, 岡本正則, 加藤博之
  • Organizer: 第2回日本レギュラトリーサイエンス学会
  • Place of Presentation: 東京
• [Presentation] カーボンナノチューブ複合ポリエチレンを人工関節の摺動部に用いるための生体安全性評価
  • Author(s): 齋藤直人, 西村直之, 薄井雄企, 羽二生久夫, 青木薫, 岡本正則, 高梨誠司, 小林伸輔, 野村博紀, 加藤博之
  • Organizer: 第5回医療機器に関するレギュラトリーサイエンス研究会
  • Place of Presentation: 東京
• [Presentation] カーボンナノチューブを用いた医療用コンポジット材料の開発
  • Author(s): 西村直之, 網島義貴, 浦部匡史, 日笠茂樹, 西勝志, 齋藤直人
  • Organizer: 第20回フィラーシンポジウム
  • Place of Presentation: 滋賀
• [Presentation] カーボンナノチューブに対する細胞反応の定量的評価法の開発: ONE TO ONE法
  • Author(s): 高梨誠司, 羽二生久夫, 石垣範雄,青木薫, 清水政幸, 岡本正則, 小林伸輔, 野村博紀, 加藤博之, 薄井雄企, 齋藤直人
  • Organizer: 第111回 信州整形外科懇談会
  • Place of Presentation: 松本
• [Presentation] 医療機器材料の生体適合性・安全性: 世界で初めてカーボンナノチューブを生体材料に応用するために
  • Author(s): 齋藤直人
  • Organizer: 第2回医工連携セミナー
  • Place of Presentation: 松本
  • Invited