ＣＮＴを応用した高機能生体材料創製のためのＣＮＴ・生体界面技術の構築と安全性評価

2013 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 24241045
• Research Institution: Shinshu University
• Principal Investigator: 齋藤 直人 信州大学, 医学部, 教授 (80283258)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 加藤 博之 信州大学, 医学部, 教授 (40204490) ; 佐々木 克典 信州大学, 医学部, 教授 (30170666) ; 樽田 誠一 信州大学, 工学部, 教授 (00217209) ; 宇田川 信之 松本歯科大学, 歯学部, 教授 (70245801) ; KIM YOONG AHM 信州大学, 工学部, 准教授 (70362100)
• Project Period (FY): 2012-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: ナノ機能材料 / ナノ粒子チューブ / カーボンナノチューブ / 生体材料 / 生体安全性

Research Abstract

CNT材料の研究として、CNTの溶液への分散と細胞への影響を、CNTと細胞の界面を中心に探求した。特に分散剤の種類による細胞反応の差異を調べ、そのメカニズムを検討した。その上で多くの分散剤で細胞内へのCNTの取り込みが見られることから、この取り込みに関与するタンパク質の同定を行った。また、凝集CNTを除去した高分散状態のCNTの基本的物性と動物・細胞レベルでの評価を試みた。さらにCNTと細胞の界面について、昨年度から継続して１本のCNTを１個の細胞に作用させる技術開発を進めた。この新手法を用いて、細胞に取り込まれたCNTの挙動、分布などを詳細に観察した。
細胞毒性の研究では、CNTの生体材料応用を念頭に置き、形状の異なるCNTおよびCNT複合体の特定の細胞に対する反応を調べ、細胞増殖性や炎症性サイトカイン/ケモカインの産生などを検討した。また、CNTを骨芽細胞や破骨細胞に作用させて細胞内/膜/外の変化を捉え、CNTが骨形成を促進するメカニズムを更に探求した。
動物試験においては、CNT材料を使用する部位や体内動態を考慮して、特定の組織とCNTの界面反応を評価した。具体的には皮下・骨・滑膜を中心に、短期評価と長期評価を実施した。また、遺伝子改変発癌性マウス（rasH2）を用いたCNTの発癌性評価を多くのバリエーションで実施し、同時に体内動態の詳細な解析も行った。
新規研究として、CNTが鼻腔から嗅球を経て脳に移行する動きを、蛍光標識したナノ粒子をモデルに、マウスで再現する試みを行った。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

CNTと細胞の反応は分散剤が強く影響することが明らかになり、CNTに吸着した分散剤によってCNTの細胞の取り込みや細胞毒性が変化することが示された。一方で細胞のCNTの取り込みは、分散剤だけでなく細胞の分化状態によっても変化することが明らかになった。また、１本のCNTを１個の細胞に作用させる技術開発を進め、細胞内に取り込まれたCNTと核やリソソームの関係を示すことができた。
特定の細胞におけるCNTまたはCNT複合体のサイトカイン・ケモカインの誘導は一定の傾向を示したが結論には至らず、今後更に再現性を高める技術開発を継続する。CNTと骨芽細胞や破骨細胞との反応は、セカンドメッセンジャーの働きやマーカー遺伝子である転写因子の活性化など細胞内の分子レベルでの評価を行っているが、既知のマーカー遺伝子より上流の遺伝子に関与している可能性が高い。このため、より広い遺伝子を対象とした解析を進めることによって、骨形成促進のメカニズム解明を試みている。
動物試験では、特定の組織界面におけるCNTの作用が明らかになり、生体材料応用の基盤となる新知見を蓄積することができた。特にCNTやCNT複合体の骨親和性や滑膜反応など、複数の新規性の高い結果が得られた。遺伝子改変発癌性マウスを用いた実験では、CNTを生体材料に応用する際の発癌性が認められないことを、再現性良く確認することができた。またCNTの脳移行に関する研究は、実験手技を確立し、本実験への進展が可能になった。
以上より、ナノマテアリルの生体応用に関して共通性と特異性の検討が今後の課題であることが明らかになった。本研究課題を含む総説「Safe clinical use of carbon nanotubes as innovative biomaterials」が、Chemical Reviews（インパクトファクター41.298）にacceptされた。

Strategy for Future Research Activity

CNT開発および材料複合技術開発を信州大学工学部/カーボン科学研究所が行う。得られた材料を、信州大学医学部/バイオメディカル研究所と松本歯科大学において密に連携を保ちながら、生体組織や細胞との界面に着目して研究を進めていく。この際、医学の様々な分野と歯学に研究分担者がおり、それぞれの専門的知識と実験手技を動員・統合して、横断的な新知見を獲得する。得られた結果は随時工学にフィードバックし、生体との界面を制御する高機能生体材料を開発していく。実用化に最も重要な生体安全性は、昨年度同様にCNT・生体界面研究の結果を反映させ、安全性評価を実施する。研究計画の最終的なゴールは、CNTの癌治療に用いるDDS、イメージング等への応用、再生医療に用いるscaffold への応用、外科用インプラントへの応用等のための確固たる基盤技術を構築することである。さらに、CNTの生体材料としての国際的な安全性評価基準を構築して、臨床応用の実現を目指す。
平成25年度からの継続研究内容：（1）CNT材料の開発研究（2）CNT材料表面における基本的生体反応の研究（3）硬組織界面の研究（4）細胞界面の研究（5）細胞毒性の研究（6）発癌性試験（7）生体内動態の研究（8）iPS 細胞・ES 細胞の研究（9）酸化ストレスの研究。
平成26年度に重点的に行う研究内容：（10）細胞表面接着の研究（11）硬組織関連細胞界面の研究（12）マクロファージ界面の研究（13）神経の研究（14）分散剤による分散CNTの細胞応答研究（15）CNTのコンポジット化による界面変化の研究（16）生体安全基準の構築。
研究進展に合わせて行う研究内容：（17）DDSに応用する研究（18）組織再生のためのscaffold に応用する研究（19）ナノマテリアル界面と生体応答の法則性の研究（20）CNTの凝集性による界面変化の研究（21）CNTと細胞間の「場」の影響の研究（22）革新的生体材料の創製

Research Products

• [Journal Article] Biological responses according to the shape and size of carbon nanotubes in BEAS-2B and MESO-1 cells (2014)
  • Author(s): Haniu H, Saito N, Matsuda N, Tsukahara T, Usui Y, Maruyama K, Takanashi S, Aoki K, Kobayashi S, Nomura H, Tanaka M, Okamoto M, Kato H
  • Journal Title: Int J Nanomed Volume: ９ Pages: 1979-1989
  • DOI: 10.2147/IJN.S58661
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Influence of CNF content on microstructure and fracture toughness of CNF/alumina composites (2014)
  • Author(s): Ueda N, Yamakami T, Yamaguchi T, Usui Y, Aoki K, Endo M, Saito N, Taruta S
  • Journal Title: J Ceram Soc Jpn Volume: 122 Pages: 192-299
  • DOI: 10.2109/jcersj2.122.292
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Noncanonical Wnt5a enhances Wnt/b-catenin signaling during osteoblastogenesis (2014)
  • Author(s): Okamoto M, Udagawa N, Uehara S, Maeda K, Yamashita T, Nakamichi Y, Kato H, Saito N, Minami Y, Takahashi N, Kobayashi Y
  • Journal Title: Sci Rep-UK Volume: 4 Pages: 4493
  • DOI: 10.1038/srep04493
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Safe clinical use of carbon nanotubes as innovative biomaterials (2014)
  • Author(s): Saito N, Haniu H, Usui Y, Aoki K, Hara K, Takanashi S, Shimizu M, Narita N, Okamoto M, Kobayashi S, Nomura H, Kato H, Nishimura N, Taruta S, Endo M
  • Journal Title: Chem Rev Volume: 115 Pages: in press
  • DOI: 10.1021/cr400341h
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Culture medium type affects endocytosis of multi-walled carbon nanotubes in BEAS-2B cells and subsequent biological response (2013)
  • Author(s): Haniu H, Saito N, Matsuda Y, Tsukahara T, Maruyama K, Usui Y, Aoki K, Takanashi S, Kobayashi S, Nomura H, Okamoto M, Shimizu M, Kato H
  • Journal Title: Toxicol in Vitro Volume: 27 Pages: 1679-1685
  • DOI: 10.1016/j.tiv.2013.04.012.
  • Peer Reviewed
• [Presentation] An innovative method to evaluate biodistribution and kinetics of carbon nanotubes using CNT peapods. (2013)
  • Author(s): Kobayashi S, Tsuruoka S, Usui Y, Haniu H, Aoki K, Shimizu M, Takanashi S, Okamoto M, Kato H, Saito N.
  • Organizer: 6th International Symposium on Nanotechnology, Occupational and Environmental Health.
  • Place of Presentation: Nagoya, Japan.
  • Year and Date: 20131028-20131031
• [Presentation] Drug delivery system by carbon nanotubes for sarcoma cells. (2013)
  • Author(s): Aoki K, Haniu H, Shimizu M, Takanashi S, Okamoto M, Kobayashi S, Nomura H, Usui Y, Kato H, Saito N.
  • Organizer: 6th International Symposium on Nanotechnology, Occupational and Environmental Health.
  • Place of Presentation: Nagoya, Japan.
  • Year and Date: 20131028-20131031
• [Presentation] Carcinogenicity evaluation of carbon nanotubes in rasH2 mice. (2013)
  • Author(s): Takanashi S, Haniu H, Usui U, Aoki K, Okamoto M, Kobayashi S, Nomura H, Tanaka M, Kato H, Saito N.
  • Organizer: The 6th International Symposium on Nanotechnology, Occupational and Environmental Health.
  • Place of Presentation: Nagoya, Japan.
  • Year and Date: 20131028-20131031
• [Presentation] Endocytosis of MWCNT in BEAS-2B cells are affected by the culture medium type. (2013)
  • Author(s): Haniu H, Saito N, Matsuda N, Maruyama K, Tsukahara T, Usui Y, Takanashi S, Aoki K, Kobayashi S, Nomura H, Okamoto M, Shimizu M, Kato H.
  • Organizer: The 6th International Symposium on Nanotechnology, Occupational and Environmental Health.
  • Place of Presentation: Nagoya, Japan.
  • Year and Date: 20131028-20131031
• [Presentation] Intraarticular reaction and secretion of inflammatory chemokines to Multi wall carbon nanotubes. (2013)
  • Author(s): Nomura H, Haniu H, Takanashi S, Kobayashi S, Okamoto M, Aoki K, Maruyama K, Usui Y, Kato H, Saito N.
  • Organizer: 6th International Symposium on Nanotechnology, Occupational and Environmental Health.
  • Place of Presentation: Nagoya, Japan.
  • Year and Date: 20131028-20131031
• [Presentation] Intraarticular reaction and secretion of inflammatory chemokines to Multi wall carbon nanotubes. (2013)
  • Author(s): Nomura H, Haniu H, Takanashi S, Kobayashi S, Okamoto M, Aoki K, Maruyama K, Usui Y, Kato H, Saito N.
  • Organizer: 8th Combined Meeting of Orthopaedic Research Societies
  • Place of Presentation: Venice, Italy.
  • Year and Date: 20131013-20131016
• [Presentation] Wnt5a enhances Wnt/ß-catenin signaling through the up-regulation of Lrp5/6 during osteogenesis.(President’s Poster Competition Award) (2013)
  • Author(s): Okamoto M, Udagawa N, Yamashita T, Uehara S, Kato H, Saito N, Minami Y, Takahashi N, Kobayashi Y.
  • Organizer: ASBMR 2013 Annual Meeting.
  • Place of Presentation: Baltimore, Maryland, USA.
  • Year and Date: 20131004-20131007
• [Presentation] Strength improvement and tissue compatibility of multi-walled carbon nanotubes-polyethylene complex for prosthetic joint. (2013)
  • Author(s): Aoki K, Takanashi S, Shimizu M, Haniu H, Kato H, Usui Y, Nishi K, Noguchi T, Nishimura N, Saito N.
  • Organizer: 25th European Conference on Biomaterials.
  • Place of Presentation: Madrid, Spain.
  • Year and Date: 20130908-20130912
• [Presentation] ROS evaluation for series of cnts using the esr method and the effects of cnt mophology. (2013)
  • Author(s): Tsuruoka S, Takeuchi K, Koyama K, Endo M, Fujisawa K, Matsumoto H, Saito N, Usui Y, Porter DW, Castranova V.
  • Organizer: TechConnect World Conference and Expo 2013.
  • Place of Presentation: Washington DC, USA.
  • Year and Date: 20130512-20130516