2013 Fiscal Year Annual Research Report
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24248010
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| Research Institution | National Institute of Agrobiological Sciences |
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Principal Investigator |
飯 哲夫 独立行政法人農業生物資源研究所, 植物科学研究領域, 領域長 (40157813)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
石川 雅之 独立行政法人農業生物資源研究所, 植物科学研究領域、植物-微生物間相互作用研究ユニット, ユニット長 (70192482)
吉川 学 独立行政法人農業生物資源研究所, 植物科学研究領域、植物-微生物間相互作用研究ユニット, 主任研究員 (80391564)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | RISC / microRNA / trans-acting siRNA / リボソーム / ウイルス / RNAサイレンシングサプレッサー |
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| Research Abstract |
RNAサイレンシングにおいては、AGO及び小分子RNAを含むRISC複合体が配列特異的な遺伝子発現調節を司る。植物では、RISCによって切断されたRNA断片が二本鎖RNAに変換されて二次的siRNAが生じ、これがウイルスに対する防御に重要な役割を果たす。二次的siRNAの生成には、22塩基長の小分子RNAとAGO1を含むRISCやSGS3、RDR6、DCL2/4などが関わっていることが明らかにされていた。
我々は、22塩基長のmiR173を含んだRISCによって切断されたRNA断片から生じるシロイヌナズナのtrans-acting siRNA (tasiRNA) をモデルとして、二次的siRNA生成機構の解析を進めている。平成25年度は、tasiRNAの鋳型となるTAS2 RNAの様態を明らかにするために、tasiRNA生成に異常をきたしたシロイヌナズナ変異体から細胞抽出液を調製し、密度勾配超遠心法による解析を行った。その結果、非コードRNAと考えられていたTAS2 RNAはmiR173 RISCに切断される前に翻訳されていること、TAS2 RNAのmiR173標的配列を含む短いオープンリーディングフレームの翻訳がtasiRNAの生成に重要であることがわかった（投稿準備中）。また、二次的siRNA生成を阻害するとの報告があるウイルスRNAサイレンシングサプレッサーp2及びV2を用いた解析を行う準備として、当該タンパク質を発現するシロイヌナズナ形質転換体を作製したが、tasiRNAの蓄積に変化は見られなかった。一方、Nicotiana benthamianaを使ったアグロインフィルトレーションによりmiR173とTAS2 RNAを１つのプラスミドから一過的に発現する実験系を構築し、これらをp2あるいはV2と共発現したところ、tasiRNA蓄積の阻害が確認できた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成25年度に計画していた実験の遂行に加えて、翻訳と二次的siRNA生成機構との関連を明らかにできたため。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成25年度には、タバコ脱液胞化プロトプラスト抽出液 (BYL) を使った試験管内翻訳反応によるRDR6タンパク質の調製も試みたが、合成された量が非常に少なかった。そこで、RDR6タンパク量の合成効率の向上を目指して、タグの位置や種類を変えること、他の植物のRDR6を使うことなどを試みる。改善が見られた場合は、二本鎖RNA合成活性、miR173切断RNAへのリクルートの可否等を調べる。また、SGS3と同様に二次的siRNA生成経路で機能することが知られているが、その機能が解明されていないSDE5について、RNA結合活性や二本鎖RNA合成促進活性の測定等in vitro解析を行う。これら個別タンパク質の解析に加えて、BYL中での二次的siRNA生成経路の再構成に向けて、条件を検討する。この際必要であれば、シロイヌナズナ培養細胞抽出液を用いる。またNicotiana benthamianaへのアグロインフィルトレーションを用いたin vivo二次的siRNA生成系を確立できたので、これを利用してウイルスRNAサイレンシングサプレッサータンパク質の性質を解析する。さらに、得られた結果をもとに、in vitro解析を進め、当該タンパク質の性質の詳細を明らかにする。
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