植物におけるＲＮＡサイレンシング増幅機構の解析

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 24248010
• Research Institution: National Institute of Agrobiological Sciences
• Principal Investigator: 飯 哲夫 独立行政法人農業生物資源研究所, 植物科学研究領域, 領域長 (40157813)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 石川 雅之 独立行政法人農業生物資源研究所, 植物・微生物間相互作用研究ユニット, ユニット長 (70192482) ; 吉川 学 独立行政法人農業生物資源研究所, 植物・微生物間相互作用研究ユニット, 主任研究員 (80391564)
• Project Period (FY): 2012-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: RISC / microRNA / trans-acting siRNA / リボソーム

Outline of Annual Research Achievements

植物には、AGOと小分子RNAを含むRISC複合体によって切断されたRNA断片を鋳型として、小分子RNAを合成するRNAサイレンシグの増幅機構がある。この機構はウイルスに対する防御に重要な役割を果たす一方、ウイルスはサプレッサーによってこの機構を抑制することが知られている。本研究は、RNAサイレンシグの増幅機構とサプレッサーの作用機作を解明することを目的としている。
我々は、miR173を含んだRISCによって切断されたRNA断片から生じるシロイヌナズナのtrans-acting siRNA (tasiRNA) をRNAサイレンシグ増幅のモデル系として、二次的siRNA生成機構の解析を進めている。
平成２６年度には、イネ縞葉枯ウイルスのp2あるいはトマト黄化葉巻ウイルスのV2とRNAサイレンシグ増幅において機能するSGS3との相互作用を、試験管内翻訳系を用いた共免疫沈降により解析した。その際、シロイヌナズナのSGS3に加えて、それぞれのウイルスの宿主であるイネ及びトマトからSGS3をクローニングして解析に用いたが、いずれの組み合わせでも相互作用は見られなかった。そこで、他のウイルスのサプレッサーを追加して調べたところ、イネ黄葉ウイルスP6がRNAサイレンシグ増幅において機能するタンパク質RDR6と相互作用することがわかった。
また、この過程で働くSDE5の解析を行うために、大腸菌で組換えタンパク質の発現を試みた。しかし、全長での発現が困難であることがわかった。そこで、部分的に欠失させたSDE5を発現させたところ、組換えタンパク質が得られたが、RNA結合活性は見られなかった。一方、シロイヌナズナのSDE5変異体を用いた遺伝学解析から、SDE5がmiR173切断RNAに作用するステップは、SGS3の後、RDR6の前であることがわかった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

平成２６年度に計画していた実験の遂行に加えて、SDE5の機能を解明する手がかりが遺伝学的に明らかにできたため。

Strategy for Future Research Activity

RNAサイレンシグ増幅機構の試験管内再構成系の確立に向けて、タバコ脱液胞化細胞抽出液を用いて、この経路に必須なことが遺伝学的に明らかになっているAGO1やSGS3などのタンパク質を調製し、それらを混合することにより、この抽出液中においてmiR173で切断されたRNAから二次的なsiRNAが生じるかを調べる。またmiR173によって生じるtasiRNAの系はもともとシロイヌナズナで見いだされたものであるため、シロイヌナズナの培養細胞を使った実験を平行して行う。再構成系が確立できたならば、その系にP6などを加えることにより、どのステップで、また、どの様にRNAサイレンシグ増幅機構が阻害されているかを調べる。
本研究におけるこれまでのin vitro解析結果と植物体内のin vivoの事象を結びつけるためDCL2及びDCL3、DCL4、RDR6遺伝子をRNAi法によって発現抑制した形質転換タバコを用いて、免疫染色法などによりタバコモザイクウイルスを接種した後の感染域の拡大を調べることにより、RNAサイレンシグ増幅機構がウイルス病の発病抑制に果たす役割を解析する。