2012 Fiscal Year Annual Research Report
チョウザメの生殖統御技術開発のための性分化、卵成長および卵成熟の分子機構解析
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24248033
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Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
足立 伸次 北海道大学, 水産科学研究科(研究院), 教授 (40231930)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
荒井 克俊 北海道大学, 水産科学研究科(研究院), 教授 (00137902)
都木 靖彰 北海道大学, 水産科学研究科(研究院), 教授 (10212002)
平松 尚志 北海道大学, 水産科学研究科(研究院), 准教授 (10443920)
山羽 悦郎 北海道大学, 北方生物圏フィールド科学センター, 教授 (60191376)
井尻 成保 北海道大学, 水産科学研究科(研究院), 准教授 (90425421)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | チョウザメ / 性分化 / 卵成長 / 卵成熟能 / 排卵能 / 生殖腺刺激ホルモン / 次世代シーケンサー / 生殖統御技術 |
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| Research Abstract |
（１） 分子機構解析研究
ロシアチョウザメの未分化生殖腺について、発現遺伝子を次世代シーケンサー（NGS）解析し、ESTデータベースを構築した。その中からこれまで得られていなかったステロイド合成酵素（cyp11a1、hsd3b）や増殖因子（gsdf、amh）など26個の性分化関連遺伝子の部分配列を得た。性分化関連遺伝子の発現量比較から判断された将来卵巣（雌）および将来精巣（雄）におけるNGSリード数比較の結果、雌特異的発現配列が数千個選抜された。それらをBLAST解析によって翻訳領域をコードしていると予測される300個程度の配列に絞り込んだ。ベステル（オオチョウザメｘコチョウザメの交雑種）およびアムールチョウザメの肝臓において新規タイプを含む2タイプのビテロゲニン（Vg）を単離した。さらに、ベステルにおける卵成熟能および排卵能の季節的変化を調べた結果、卵成熟能は7月以降に獲得され始め、9月には完了し、その後、11月から1月にかけて一部の個体の卵濾胞は排卵能を獲得することが解った。卵成熟・排卵に必要な因子を探索するため、アムールおよびダウリアチョウザメ（カルーガ）の卵成熟および排卵前後の卵巣から、NGS解析用サンプルを調整した。
（２） 生殖統御技術開発研究
カラム（カルーガｘアムールの天然交雑種）の採卵に成功し、カラムトラ（カラムｘシロチョウザメ）、カラムミカド（カラムｘミカドチョウザメ）が作出できた。ベステルの採卵にも成功し、ベストラ（ベステルｘシロチョウザメ）およびベストラ3倍体が作出できた。カルーガ、アムール、ミカド、ロシアについて、DNA量を計測したところ約8-9 pg/体細胞核であったことから、進化的な4倍体あるいは8倍体であることが確認できた。また、いくつかの人為交雑種の中には3倍体個体が出現した。また、カラム雌性発生魚の作出にも成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
（１）分子機構解析研究
性分化関連遺伝子に関しては、NGS解析により26個の性分化関連遺伝子の部分配列を得ることに成功し、雌特異的に発現がみられる候補配列も300個程度にまで絞り込むことができ、予想以上の成果が得られた。卵成長関連遺伝子に関しては、肝臓から新規タイプを含む2タイプのVgを確認できたが、卵巣のNGS解析は次年度に残された。チョウザメの場合、卵成熟および排卵は飼育下では起こらず、ホルモン（生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン；GnRH を使用する場合が多い）注射によってのみ誘導可能である。そのため、バイオプシーにより卵巣の一部を摘出し、生体外培養で卵成熟能を確認した後、GnRH注射を行うことで卵を得ている。しかし、GnRH注射のタイミングの見極めは難しく、必ずしも良質卵は得られない。これは、注射のタイミングが遅れたことによる卵母細胞の排卵前過熟も原因のひとつと予想される。本年度は、ベステルの卵成熟能および排卵能の季節的変化を把握でき、アムールおよびカルーガの卵成熟および排卵関連遺伝子探索のためのNGS解析用サンプルを得ることはできたが、NGS解析は次年度に残された。
（２）生殖統御技術開発研究
早期成熟個体の作出は選抜育種や交雑が近道であると思われ、本年度はいくつかの交雑種の作出にも成功した。しかし、異種間生殖細胞移植、すなわち借腹養殖による早期成熟技術開発は次年度以降に残された。また、交雑種の倍数性の確認は予定通り行なわれた。ホルモンを用いないチョウザメの全雌生産技術開発に関しては、これまで成功例はないが、（１）の性分化関連遺伝子の特定が予想以上に進行しており、これら研究の中から雌特異的塩基配列が発見できれば、全雌生産技術確立に飛躍的に近づく。
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| Strategy for Future Research Activity |
（１）分子機構解析研究
ロシアチョウザメ未分化生殖腺ESTデータベースから得られた性分化関連遺伝子を同定し、完全長cDNAをクローニングし、生殖腺の発達に伴うそれら発現変化を調べる。性成熟中の卵巣のNGS解析データからは卵巣発達に関わる細胞外基質関連因子の同定を行なう。また、卵成熟・排卵誘導した親魚から経時的に摘出した卵巣における包括的なRNA発現変化を解析し、卵成熟・排卵に必要な因子を探索する。また、性成熟中の雌個体の肝臓におけるNGS解析を行ない、未同定タイプのVgあるいはVg以外の肝臓におけるエストロゲン応答性遺伝子（雌特異発現遺伝子候補）を同定する。
（２）生殖統御技術開発研究
引き続き、可能な限り純系種および交雑種を作出し、早期成熟雄個体を選抜する。また、交雑種の倍数性および妊性を確認する。同時に、遺伝学的手法（DNAマーカーの解析）と細胞遺伝学的手法（FISH、GISH）を用いて、種間のゲノム量変異のみならず、種内でも生じるゲノム量変化（遺伝的な三倍体の出現）の出現機構解明を目指す。また、チョウザメ神経胚から始原生殖細胞を単離し、異種胚に移植する。チョウザメはZZ/ZW型性決定をすることが示唆されており、申請者らは、数種のチョウザメで遺伝的雌（ZW）の雄化処理（偽雄つくり）はすでに行なっている。また、雌性発生のベステル雌親（WW超雌を含む可能性もある）も有しており、近く採卵が可能である。これら偽雄および雌性発生魚を用いて授精を行ない、子孫第１世代をさらにアンドロゲン処理することでWW超雌偽雄の作出を目指す。また、可能な限り雌性発生魚も作出する。
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