2013 Fiscal Year Annual Research Report
チョウザメの生殖統御技術開発のための性分化、卵成長および卵成熟の分子機構解析
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24248033
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
足立 伸次 北海道大学, 水産科学研究科(研究院), 教授 (40231930)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
荒井 克俊 北海道大学, 水産科学研究科(研究院), 教授 (00137902)
都木 靖彰 北海道大学, 水産科学研究科(研究院), 教授 (10212002)
平松 尚志 北海道大学, 水産科学研究科(研究院), 准教授 (10443920)
山羽 悦郎 北海道大学, 北方生物圏フィールド科学センター, 教授 (60191376)
井尻 成保 北海道大学, 水産科学研究科(研究院), 准教授 (90425421)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | チョウザメ / 性分化 / 卵成長 / 卵成熟能 / 排卵能 / 生殖腺刺激ホルモン / 次世代シーケンサー / 生殖統御技術 |
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| Research Abstract |
１．分子機構解析研究
ロシアチョウザメ未分化生殖腺ESTdbから暫定部分配列を得た性分化関連遺伝子をクローニングし、形態的未分化生殖腺におけるmRNA発現を調べた結果、gsdfは将来精巣、hsd17b1は将来卵巣特異的に発現が高い性的２型を示すことが明らかになった。新たに作成したアムールチョウザメの卵成長期卵濾胞ESTdbから卵成長、卵成熟、排卵関連因子、細胞外基質関連因子を探索した結果、卵成長関連（ステロイド合成酵素、GTH受容体など）、卵成熟関連（mpr、cyclinBなど）、排卵関連（mmp2、cox2など）、細胞外基質関連（bgn、dcnなど）、少なくとも計40遺伝子の暫定部分配列を得ることができた。また、エストロゲン処理アムールチョウザメの肝臓ESTdbの中から、新規エストロゲン応答性遺伝子を探索した結果、ZP様部分配列を含む卵膜関連因子部分配列がチョウザメ類で初めて得られた。
２．生殖統御技術開発研究
アムールチョウザメの採卵に成功し、多数の稚魚を得た。ベステルの採卵にも成功し、ベスタム（ベステルｘアムールチョウザメ）およびベスタム3倍体が作出できた。雌性発生2倍体ベステル親魚からの採卵には成功したが、孵化仔魚は得られなかった。雄化処理魚（偽雄候補）からの採精にも成功し、子孫第１世代も得られた。体細胞核DNA量から分類したAグループ（約4pg）とBグループ（約8pg）チョウザメ計8種について、既報の24マイクロサテライトDNA座および12RAPDプライマーの分析条件を最適化し、自然倍数体出現機構解析および人為雌性発生の遺伝的確認の準備を行なった。また、座毎の最大アレル数が、AおよびBグループは4および8であった。ベステルの始原生殖細胞（PGCs）の可視化技術を確立し、発生における動態観察から、カエル胚と同様にPGCsが植物極側で形成されるを、キンギョ胚への移植実験から、他の硬骨魚同様の過程で生殖腺形成領域に到達することを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
１．分子機構解析研究
性分化関連遺伝子に関しては、これまでのfoxl2、cyp19a1aに加えて、新たにgsdfとhsd17b1遺伝子の形態的未分化生殖腺における性的２型発現を明らかにすることができ、予想以上の成果が得られた。卵成長、卵成熟、排卵関連および細胞外基質遺伝子に関しては、新たに作成したESTdbから約40遺伝子の暫定部分配列を獲得することができたが、完全長決定と発現解析は次年度に残された。肝臓ESTdbからはチョウザメ類で既知のVtg1およびVtg2とは異なる、新規Vtg遺伝子と考えられる暫定配列が得られ、また真骨魚類以外では初めて肝臓における卵膜関連因子の発現が示唆されたことは予想以上の結果であった。
２．生殖統御技術開発研究
本年度は純系種アムールチョウザメ、交雑種ベスタムおよびベスタム3倍体が作出できた。雌性発生2倍体ベステル親魚からの採卵には成功したが、孵化仔魚は得られなかった。雄化処理魚の子孫第１世代も得られたが、性比確認は次年度以降に残された。ベステルPGCsの可視化技術を確立し、PGCsが植物極側で形成されること、他の硬骨魚同様の過程で生殖腺形成領域に到達することを明らかにし、生殖系列キメラを利用した生殖統御技術の基礎を固めることができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
１．分子機構解析研究
昨年度までにNGSにより作成したチョウザメ未分化生殖腺ESTdbと卵成長期卵濾胞ESTdbから獲得した性分化、卵成長、卵成熟、排卵関連遺伝子群について、全長配列を決定し、生殖腺の発達に伴う発現変化を解析し、性分化・卵成長・卵成熟・排卵の分子機構を調べる。また、上記ESTdbから得た細胞外基質遺伝子についても、クローニングおよび発現解析を行なう。肝臓ESTdbから暫定配列を獲得した卵黄前駆タンパク質について、クローニングを行い、組み換えタンパク特異抗体を作製し、免疫化学的検出系あるいは測定系を確立する。
２．生殖統御技術開発研究
早期性判別技術開発は、NGSのリードマッピング解析により得られた予定卵巣特異的に発現が検出された候補配列群について、それぞれ特異的なプライマーを設計し、gDNAをPCRすることにより性連鎖性を検証する。
早期成熟個体の作出には選抜育種や交雑あるいは異種間生殖細胞移植（借腹養殖）が有効である。昨年度に引き続き、可能な限り純系種および交雑種を作出し、早期成熟雄個体を選抜する。また、交雑種の倍数性および妊性を確認する。同時に、遺伝学的手法と細胞遺伝学的手法を用いて、種間のみならず、種内でも生じる自然倍数体出現機構解明を目指す。また、チョウザメ神経胚から始原生殖細胞を単離し、異種胚に移植する。
チョウザメはZZ/ZW型性決定をすることが示唆されており、我々は、数種のチョウザメで遺伝的雌（ZW）の雄化処理（偽雄つくり）はすでに行なっている。また、雌性発生のベステル雌親（WW超雌を含む可能性もある）も有している。一昨年度、昨年度は雌性発生ベステルからの稚魚が得られなかったことから、今年度も偽雄および雌性発生魚を用いて授精を行ない、子孫第１世代をさらにアンドロゲン処理することによりWW超雌偽雄の作出を目指す。また、可能な限り雌性発生魚も作出する。
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