先端の構造解析技術を駆使したニトリル水和酵素ファミリーの触媒機構と成熟化機構解明

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 24350082
• Research Institution: Akita University
• Principal Investigator: 尾高 雅文 秋田大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (20224248)
• Project Period (FY): 2012-04-01 – 2015-03-31
• Keywords: 酵素触媒機構 / 金属酵素 / 構造生物学 / 時間分割結晶構造解析 / 中性子構造解析 / 水和反応 / 反応中間体

Outline of Annual Research Achievements

昨年度までに時間分割X線結晶構造解析から、基質のニトリル基が反応中心金属に配位後、システインスルフェン酸基のSO-基がニトリル炭素を求核攻撃し、新規な環状中間体を生じることを明らかにした。本年度は、環状中間体形成以降の過程を明らかにするために、以下の研究を行った。
1．質量分析による水の取り込み過程の解析：環状中間体形成後に水分子がどのように反応するかを明らかにするために、18Oラベルした水分子中で触媒反応を行い、酵素と基質に対する18Oの取り込みを質量分析で解析する手法を検討した。18Oラベルした水で作製した緩衝液中に凍結乾燥させたNO結合型不活性NHaseを溶解し、0.3等量の基質を加えて反応させた後、精製した生産物の質量を測定したところ、理論値よりも2Mass増大しており、水由来の18Oは生産物に取り込まれる可能性が示唆された。しかし、昨年、行ったFTIRによる結果と矛盾していることと、代謝回転数から考えて、同一の酵素が複数回触媒している可能性も無視できないため、酵素側の同位体取り込みの検出法を行う必要が考えられた。
2．βR56K以外の変異体による時間分割構造解析：βR56Kで得られたものとは異なる反応中間体構造を決定するために、βR141K、βR167K変異体発現系を構築した。現在、構築した発現系を用いて、変異体酵素の大腸菌による発現系構築と精製を行っている。
3．中性子構造解析のための結晶化：中性子構造解析を行う上で、結晶化中に分子間でS-S結合を生じてしまう可能性があるため、βC146S, αC195S二重変異体発現プラスミドを構築した。

Research Progress Status

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Causes of Carryover

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Expenditure Plan for Carryover Budget

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Remarks

最終年度までの研究成果を現在、論文に投稿中。

Research Products

• [Presentation] Reaction mechanism of nitrile hydratase proposed by the high resolution transition state structure of the enzyme-substrate complex (2014)
  • Author(s): Yasuaki Yamanaka, Yuki Kato, Koichi Hashimoto, Keisuke Iida, Kazuo Nagasawa, Hiroshi Nakayama, Naoshi Dohmae, Keiichi Noguchi, Takumi Noguchi, Masafumi Yohda, Masafumi Odaka
  • Organizer: 7th Asian Biological Inorganic Chemistry Conference
  • Place of Presentation: Surfers Paradise, Gold Coast
  • Year and Date: 2014-11-30 – 2014-12-05