2013 Fiscal Year Annual Research Report
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24370066
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
神山 勉 名古屋大学, 理学(系)研究科(研究院), 教授 (30170210)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
井原 邦夫 名古屋大学, 遺伝子実験施設, 准教授 (90223297)
村上 緑 名古屋大学, 理学(系)研究科(研究院), 助教 (20324387)
岩佐 達郎 室蘭工業大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (00133926)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | レチナール蛋白質 / X線結晶構造解析 / 光駆動プロトンポンプ / 視物質 / 塩素イオンポンプ |
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| Research Abstract |
25年度の成果の概要：１）古細菌型ロドプシンの構造解析：1-1≫光駆動プロトンポンプの構造解析。①好熱性好塩菌Halorubrum Aus-2由来のアーキロドプシン－２の新規の結晶を作成し、その基底状態の構造を高分解能で求め、プロトン放出基の実体を明らかにした。②高度好塩菌Haloarcula vallismortis由来のCruxrhodopsinの結晶構造解析を行い、3量体構造の安定化に寄与する構造因子を明らかにした。③バクテリオロドプシン（BR）の膜表面から飛び出したループ部分をハロロドプシン（ｐHR）のものに置き換えたBR・pHRキメラ蛋白質を作製し、その分光特性を調べた。1-2≫塩素イオンポンプの構造解析：①アルカリ性好塩菌Halonomonas pharaonis由来のハロロドプシンのN中間体の構造解析を行い、ハロゲン原子がレチナール・シッフ塩基の細胞質側に移動する様子を明らかにした。２）無脊椎動物系ロドプシンの構造解析：2-1>イカロドプシンのルミ中間体の構造を決定した。2-2>タコロドプシンの結晶を作成した。しかし、歩留まりが悪いままの状況にある。３）クライオ原子間力顕微鏡による構造解析：①クライオ原子間力顕微鏡の改良を行い、タンパク質結晶の凍結割断面を冷却エタノール中で観測できるようにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
１）古細菌型ロドプシンの構造解析：1-1≫2種類の光駆動プロトンポンプ（アキロドプシン２、クラックスロドプシン３）の構造解析は順調に進んだ。バクテリオロドプシン（BR）の膜表面から飛び出したループ部分をハロロドプシン（ｐHR）のものに置き換えたBR・pHRキメラ蛋白質については、少し手間取ったものの、大量発現系の作製に成功し、結晶構造解析への道のりの中での最大の難関を乗り越えることができた。1-2≫塩素イオンポンプの構造解析：①アルカリ性好塩菌Halonomonas pharaonis由来のハロロドプシンのN中間体の構造決定を行ったが、目標とする分解能（２Å）に到達するにはさらなるど努力が必要である。1-３≫光センサーとして働くセンサリーロドプシン（ｓR２）の結晶化を試みたが、今のところ良質な結晶は作成できない。別の種類のセンサリーロドプシン（ｓR1)の結晶化に向けての取り組みを開始したが、大量発現系の作製にてこずっている段階にある。―1２）無脊椎動物系ロドプシンの構造解析：2-1>イカロドプシンのルミメタ中間体の構造を決定できたが、メタロドプシンの構造解析までには至っていない。2-2>タコロドプシンの結晶を得たものの、歩留まりが悪いので、結晶化条件の精密化を行う必要がある。３）クライオ原子間力顕微鏡による構造解析：①タンパク質結晶の凍結割断面を冷却エタノール中で観測できるように改良したが、施策した装置の安定性が悪い。装置の冷却・昇温を繰り返してもどの部品も壊れないようにしないといけない。
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| Strategy for Future Research Activity |
26年度の研究計画：１）古細菌型ロドプシンの構造解析：1-1≫光駆動プロトンポンプの構造解析。①バクテリオロドプシン（BR）の膜表面から飛び出したループ部分をハロロドプシン（ｐHR）のものに置き換えたBR・pHRキメラ蛋白質の精製法を確立し、3次元結晶化を試みる。良質な結晶が得られ次第、基底状態ならびに反応中間体の構造解析に着手する。②2好熱性好塩菌Halorubrum Aus-2由来のアーキロドプシン－２の結晶化条件の精密化を行い、高分解能（できれば１.5Å以上）での構造解析を企てる。③高度好塩菌Haloarcula vallismortis由来のCruxrhodopsinの3量体構造の安定化に寄与する構造因子を分光学的手法を用いて調べる。1-2≫塩素イオンポンプの構造解析：①アルカリ性好塩菌Halonomonas pharaonis由来のハロロドプシンのN中間体の構造解析を高精度で行い、ハライドイオンのみならず、水分子の動きも解明できるように努力する。1-３≫光センサーとして働くセンサリーロドプシン：昨年度に引き続き、ｓR２およびｓR1の結晶化を試みる。２）無脊椎動物系ロドプシンの構造解析：2-1>イカロドプシンのメタ中間体の構造決定を試みる。2-2>タコロドプシンの結晶化条件の精密化を図る。３）クライオ原子間力顕微鏡による構造解析：①クライオ原子間力顕微鏡の改良を引き続き行い、タンパク質結晶の凍結割断面を冷却エタノール中で安定して観測できるようにする。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
クライオ原子間力顕微鏡の改良にてこずったため。
クライオ原子間力顕微鏡の改良をなんとしても成功させる。
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[Journal Article] A blue-shifted light-driven proton pump for neural silencing.2013
Author(s)
Sudo Y, Okazaki A, Ono H, Yagasaki J, Sugo S, Kamiya M, Reissig L, Inoue K, Ihara K, Kandori H, Takagi S, Hayashi S.
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Journal Title
J Biol Chem.
Volume: 288
Pages: 20624-32
DOI
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[Journal Article] Exome sequencing of senescence-accelerated mice (SAM) reveals deleterious mutations in degenerative disease-causing genes.2013
Author(s)
Tanisawa K, Mikami E, Fuku N, Honda Y, Honda S, Ohsawa I, Ito M, Endo S, Ihara K, Ohno K, Kishimoto Y, Ishigami A, Maruyama N, Sawabe M, Iseki H, Okazaki Y, Hasegawa-Ishii S, Takei S, Shimada A, Hosokawa M, Mori M, Higuchi K, Takeda T, Higuchi M, Tanaka M.
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Journal Title
BMC Genomics
Volume: 14
Pages: 248
DOI
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