2014 Fiscal Year Annual Research Report
オプトジェネティクス技術を活用したヤギ卵胞発育制御メカニズムの解明
| Project/Area Number |
24380154
|
|---|
| Research Institution | Nagoya University |
|---|
Principal Investigator |
大蔵 聡 名古屋大学, 生命農学研究科, 教授 (20263163)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
松田 二子 名古屋大学, 生命農学研究科, 准教授 (10608855)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2016-03-31
|
| Keywords | 応用動物 / 神経科学 / 獣医学 / 畜産学 / GnRH / ヤギ / キスペプチン / ニューロキニンB |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、家畜の卵胞発育を制御する視床下部神経機構において、神経ペプチドのひとつであるニューロキニンBが黄体形成ホルモン分泌頻度を亢進し、卵胞発育を刺激するメカニズムについてヤギを用いて解明することを目的とする。
視床下部弓状核の「KNDyニューロン」特異的に光感受性イオンチャネルを発現する遺伝子改変ヤギを作出するため、ヤギニューロキニンB遺伝子（TAC3）プロモーター領域およびTAC3転写調節因子の探索を実施した。当研究室で樹立したヤギKNDyニューロン不死化細胞株を用いたルシフェラーゼアッセイにより、ヤギTAC3の-197～+166の領域にコアプロモーターが存在することを確認した。
また、アデノ随伴ウィルス（AAV）ベクターを用いた遺伝子改変技術を適用するため、ヤギに適したAAV血清型を検討した。4つの血清型のAAV（AAV-1、2、5、DJ）をヤギ視床下部に注入し、赤色蛍光タンパク質レポーター遺伝子の発現強度からAAV-1およびAAV-DJによる遺伝子導入効率が高いことを特定した。さらに、ヤギKNDyニューロン不死化細胞株にAAVを感染させ、AAV-2、AAV-5およびAAV-DJで導入効率が高いことを確認した。以上より、ヤギKNDyニューロンへの遺伝子導入にはAAV-DJが最も適していることが確認できた。また、ゲノム編集ツールであるTALENを用いて、キスペプチン遺伝子（KISS1）にCreリコンビナーゼを組み込んだKISS1-Creノックインヤギの作出をめざし、ヤギKISS1の終止コドン近傍を切断するTALENの有用性を検討した。その結果、設計したTALENによりヤギKISS1遺伝子座に変異が導入できることを確認した。
さらに、KNDyニューロン特異的に光感受性イオンチャネルを発現するヤギの作出後に用いる実験系確立のため、視床下部神経活動を記録しながらレーザー光照射を行う手法の開発を前年度に引き続き行った。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度の研究計画では、ヤギTAC3のゲノム構造情報を利用して、ヤギTAC3プロモーター領域およびTAC3転写調節因子の探索を行うことを予定していた。その結果、ヤギTAC3遺伝子のコアプロモーター領域の同定は完了した。TAC3転写調節因子の同定には至っていないが、その候補因子に関する情報の収集はできた。また、KNDyニューロン特異的に光感受性イオンチャネルを発現するヤギの作出のために、アデノ随伴ウィルス（AAV）ベクターを用いた遺伝子改変技術をCre-loxPシステムと組み合わせて適用することを発案し、ヤギKNDyニューロンに高効率で遺伝子導入できる最適なAAV血清型を特定した。これにより、AAVベクターを用いた遺伝子改変技術をヤギに適用して、KNDyニューロン特異的に光感受性イオンチャネルを発現するヤギモデルの作出が可能であることが実証できた。さらに、ゲノム編集ツールのひとつであるTALENを用いてヤギKISS1遺伝子座に変異を導入できることが確認でき、KISS1-Creノックインヤギの作出のために重要な知見を得ることができた。視床下部神経活動記録法と組み合わせたレーザー光照射手法の確立はやや遅れているが、レーザー光照射のための光ファイバーを組み込んだ電極の設計は既に完了しており、次年度にはヤギへの電極留置と神経活動の記録をめざす予定である。
|
| Strategy for Future Research Activity |
本研究では、ヤギTAC3プロモーター領域下流にチャネルロドプシン2（ChR2）またはハロロドプシン（HR）遺伝子を安定的に発現する細胞系を樹立した後に、体細胞クローン技術を利用して弓状核のKNDyニューロン特異的にChR2およびHRを発現する遺伝子改変ヤギを作出することを当初の目的としていた。近年のオプトジェネティクス技術の発展はめざましく、より感度の高い光感受性イオンチャネルが利用できるようになってきたため、HRの代替としてアーキロドプシン（ArchT）を用いることとした。また、相同組換えによる遺伝子導入にはゲノム編集ツールのひとつであるTALENを用いることを予定していた。TALENによりヤギ体細胞（繊維芽細胞）の目的とする遺伝子座に変異が導入できることは確認したが、遺伝子改変ヤギの作出には相当の時間を要することが想定される。そこで、Cre-loxPシステムとアデノ随伴ウィルス（AAV）ベクターを用いた遺伝子改変技術を併用し、KNDyニューロン特異的に光感受性イオンチャネルを発現するヤギの作出を並行して実施することとした。そのため、ヤギTAC3プロモーター領域の下流にCreリコンビナーゼ遺伝子を組み込んだAAVベクターと、ChR2およびArchT遺伝子がloxP配列にはさまれて逆向きに組み込まれたAAVベクターを視床下部弓状核に直接感染させることにより、弓状核のKNDyニューロン特異的にChR2およびArchTを発現するヤギの作出を試みることとした。ヤギ視床下部において高効率に遺伝子導入できるAAVベクターの血清型の同定は完了しており、今後は遺伝子改変ヤギ作出に向けて研究を進展させる。
|
-
[Journal Article] The luteinising hormone surge-generating system is functional in male goats as in females: involvement of kisspeptin neurones in the medial preoptic area.2015
Author(s)
Matsuda, F., Nakatsukasa, K., Suetomi, Y., Naniwa, Y., Ito, D., Inoue, N., Wakabayashi, Y., Okamura, H., Maeda, K.-I., Uenoyama, Y., Tsukamura, H. and Ohkura, S.
-
Journal Title
Journal of Neuroendocrinology
Volume: 27
Pages: 57-65
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
-
-
[Journal Article] Structure-activity relationship study on senktide for development of novel potent neurokinin-3 receptor selective agonists.2015
Author(s)
Misu, R., Yamamoto, K., Yamada, A., Noguchi, T., Ohno, H., Matsuda, F., Ohkura, S., Oishi, S. and Fujii, N.
-
Journal Title
Medicinal Chemistry Communications
Volume: 6
Pages: 469-476
DOI
Peer Reviewed
-
[Journal Article] Ovarian and hormonal responses to follicular phase administration of investigational metastin/kisspeptin analog, TAK-683, in goats.2014
Author(s)
Goto, Y., Endo, N., Nagai, K., Ohkura, S., Wakabayashi, Y., Tanaka, A., Matsui, H., Kusaka, M., Okamura, H. and Tanaka, T.
-
Journal Title
Reproduction in Domestic Animals
Volume: 49
Pages: 338-342
DOI
Peer Reviewed
-
[Journal Article] KISS1 gene expression in the developing brain of female pigs in pre- and peripubertal periods.2014
Author(s)
Ieda, N., Uenoyama, Y., Tajima, Y., Nakata, T., Kano, M., Naniwa, Y., Watanabe, Y., Minabe, S., Tomikawa, J., Inoue, N., Matsuda, F., Ohkura, S., Maeda, K.-I. and Tsukamura, H.
-
Journal Title
Journal of Reproduction and Development
Volume: 60
Pages: 312-316
DOI
Peer Reviewed / Open Access
-
[Journal Article] Development of novel neurokinin 3 receptor (NK3R) selective agonists with resistance to proteolytic degradation.2014
Author(s)
Misu, R., Oishi, S., Yamada, A., Yamamura, T., Matsuda, F., Yamamoto, K., Noguchi, T., Ohno, H., Okamura, H., Ohkura, S. and Fujii, N.
-
Journal Title
Journal of Medicinal Chemistry
Volume: 57
Pages: 8646-8651
DOI
Peer Reviewed
-
[Journal Article] Oestrogen-induced activation of preoptic kisspeptin neurones may be involved in the luteinising hormone surge in male and female Japanese monkeys.2014
Author(s)
Watanabe, Y., Uenoyama, Y., Suzuki, J., Takase, K., Suetomi, Y., Ohkura, S., Inoue, N., Maeda, K.-I. and Tsukamura, H.
-
Journal Title
Journal of Neuroendocrinology
Volume: 26
Pages: 910-918
DOI
Peer Reviewed
-
[Journal Article] The effects of chronic subcutaneous administration of an investigational kisspeptin analogue, TAK-683, on gonadotropin-releasing hormone pulse generator activity in goats.2014
Author(s)
Yamamura, T., Wakabayashi, Y., Sakamoto, K., Matsui, H., Kusaka, M., Tanaka, T., Ohkura, S. and Okamura, H.
-
Journal Title
Neuroendocrinology
Volume: 100
Pages: 250-264
DOI
Peer Reviewed
-
-
-
[Presentation] Development of novel neurokinin-3 receptor selective agonists with registance against proteolytic degradation.2014
Author(s)
Misu, R., Oishi, S., Yamada, A., Yamamoto, K., Noguchi, T., Ohno, H., Yamamura, T., Okamura, H., Matsuda, F., Ohkura, S. and Fujii, N.
Organizer
The 51st Japanese Peptide Symposium
Place of Presentation
Tokushima, Japan
Year and Date
2014-10-22 – 2014-10-24
-
-
[Presentation] Development of novel neurokinin-3 receptor agonists that potently stimulate the GnRH pulse generator.2014
Author(s)
Yamamura, T., Misu, R., Wakabayashi, Y., Ohkura, S., Oishi, S., Fujii, N. and Okamura, H.
Organizer
The 3rd World Congress on Reproductive Biology
Place of Presentation
Edinburgh, UK
Year and Date
2014-09-02 – 2014-09-04
-
[Presentation] Differential changes in LH secretion after administration of investigational metastin/kisspeptin analog TAK-683 to goats.2014
Author(s)
Tamesaki, C., Endo, N., Ohkura, S., Wakabayashi, Y., Matsui, H., Tanaka, A., Watanabe, T., Okamura, H. and Tanaka, T.
Organizer
The 3rd World Congress on Reproductive Biology
Place of Presentation
Edinburgh, UK
Year and Date
2014-09-02 – 2014-09-04
-
[Presentation] Endocrine responses and ovarian dynamics in goats treated with low dose of investigational metastin/kisspeptin analog TAK-683 in follicular phase.2014
Author(s)
Gomi, N., Endo, N., Ohkura, S., Wakabayashi, Y., Matsui, H., Matsumoto, H., Ishikawa, K., Tanaka, A., Watanabe, T., Okamura, H. and Tanaka, T.
Organizer
The 3rd World Congress on Reproductive Biology
Place of Presentation
Edinburgh, UK
Year and Date
2014-09-02 – 2014-09-04
-
[Presentation] Establishment of immortalized neuronal cell lines derived from domestic ruminant hypothalamus.2014
Author(s)
Suetomi, Y., Kato, M., Matsuyama, S., Kimura, K., Tsukamura, H., Ohkura, S. and Matsuda, F.
Organizer
9th International Ruminant Reproduction Symposium
Place of Presentation
Obihiro, Japan
Year and Date
2014-08-25 – 2014-08-29
-
-
-
-
-
-
