イヌＥＳ細胞・ｉＰＳ細胞の血液系再生医療に向けた応用的基盤技術の開発

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 24380172
• Research Institution: Osaka Prefecture University
• Principal Investigator: 稲葉 俊夫 大阪府立大学, 生命環境科学研究科(系), 教授 (00137241)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 今井 裕 京都大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (10303869) ; 杉浦 喜久弥 大阪府立大学, 生命環境科学研究科(系), 准教授 (30171143) ; 鳩谷 晋吾 大阪府立大学, 生命環境科学研究科(系), 准教授 (40453138) ; 玉田 尋通 大阪府立大学, 生命環境科学研究科(系), 教授 (10155252) ; 川手 憲俊 大阪府立大学, 生命環境科学研究科(系), 准教授 (80221901) ; 谷 浩行 大阪府立大学, 生命環境科学研究科(系), 准教授 (00305658)
• Project Period (FY): 2012-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 再生医療 / 統合動物科学 / ES細胞 / iPS細胞 / バイオテクノロジー / イヌ

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、ヒトと共通の疾病が自然発症するイヌに着眼し、ヒト再生医療の実用化を円滑に進め得るトランスレーショナルリサーチの一つとして、イヌ胚性幹細胞（ES細胞）および人工多能性幹細胞（iPS細胞）の血液系再生医療に向けた応用的基盤技術の開発を目的としている。本研究年度では、3種類のリプログラミング誘導系を用いたiPS細胞の作製、継代、および本細胞から間葉系幹細胞(MSC)への分化誘導について検討し、以下の結果を得た。
1. イヌ胎子線維芽細胞を用い、ヒトOCT3/4、SOX2、KLF4およびc-MYC（山中4因子）など種々の初期化遺伝子を組み込んだプラスミドDNA（染色体に組み込まれないエピソーマルベクター）をエレクトロポレーション法で遺伝子導入することにより、核／細胞質比の高いiPS様細胞コロニーが得られ、6継代まで維持できた。一方、ドキシサイクリン誘導性レンチウイルスベクターを用いることにより、本薬剤依存性に増殖する類似の細胞コロニーが得られ、30継代以上維持できた。さらに、細胞質内で自らのゲノムを複製して目的タンパク質を作るセンダイウイルスベクターを用いても類似の細胞コロニーが得られ、7継代まで維持できた。
2. 上記のドキシサイクリン誘導性イヌiPS様細胞は、OCT3/4、NANOGなどの未分化マーカーを発現し、浮遊培養にて胚様体を形成し、三胚葉へ分化することが確認された。さらに、本iPS様細胞は単一細胞での継代が可能で、しかも、フィーダー細胞を必要とせずに、マトリゲル上で増殖・継代させることができた。
3. 上記のドキシサイクリン誘導性イヌiPS様細胞をMSC分化培地で培養することにより、紡錘形の形態を示し、CD44およびCD90陽性、CD34およびCD45陰性を示すMSC様細胞が得られた。本MSC様細胞は骨および神経への分化能を有し、9継代以上維持できた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

今年度に予定していた①細胞の凍結保存法、および②臨床応用には至らず、来年度から行うこととなったため。

Strategy for Future Research Activity

今年度に引き続いて、①細胞の長期継代培養法および凍結保存法の確立、②piggyBacおよびドキシサイクリンを用いたリプログラミング誘導系によるiPS細胞の安定的樹立と細胞分化制御、③イヌ固有の幹細胞成長因子、顆粒球コロニー刺激因子などの特異的サイトカインを用いて、イヌES細胞・iPS細胞から血小板および顆粒球等の血液系細胞へ効率的に分化誘導する技術の開発、および④iPS細胞の臨床応用を目指す。

Research Products

• [Journal Article] Effect of ovarian hormones on maturation of dendritic cells from peripheral blood monocytes in dogs (2015)
  • Author(s): Wijewardana V, Sugiura K, Wijesekera DP, Hatoya S, Nishimura T, Kanegi R, Ushigusa T, Inaba T.
  • Journal Title: Journal of Veterinary Medical Science Volume: 77 Pages: 771-775
  • DOI: org/10.1292/jvms.14-0558
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Enhancement of anti-tumor immune responses by transfection of IFNγ gene into tumor using a novel type synthetic vector (2014)
  • Author(s): Wijesekera DPH, Sugiura K, Yuba E, Ueda K, Wijewardana V, Kanegi R, Nishimura T, Ushigusa T, Hatoya S, Kono K, Inaba T.
  • Journal Title: Veterinary Immunology and Immunopathology Volume: 162 Pages: 59-64
  • DOI: 10.1016/j.vetimm.2014.08.016
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Development of a dendritic cell-targeting lipopeptide as an immunoadjuvant that inhibits tumor growth without inducing local inflammation (2014)
  • Author(s): Akazawa T, Ohashi T, Nakajima H, Nishizawa Y, Kodama K, Sugiura K, Inaba T, Inoue N.
  • Journal Title: International Journal of Cancer Volume: 135 Pages: 2847-2856
  • DOI: org/10.1292/jvms.14-0558
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Feeder-independent and serum-free canine induced pluripotent stem cells reprogrammed by a drug-inducible system (2015)
  • Author(s): Nishimura T, Kanegi R, Wijewardana DPH, Sugiura K, Hatoya S, Kawate N, Tamada H, Imai H, Inaba T.
  • Organizer: The International Society for Stem Cell Research (ISSCR) 13th Annual Meeting
  • Place of Presentation: Stockholm (Sweden)
  • Year and Date: 2015-06-24 – 2015-06-27
• [Presentation] Ovarian hormones modulate the maturation of dendritic cells from peripheral blood monocytes in dogs (2014)
  • Author(s): Wijewardana V, Sugiura K, Inaba T.
  • Organizer: Sri Lanka Japan Collaborative Research-2014
  • Place of Presentation: Kandy (Sri Lanka)
  • Year and Date: 2014-12-14 – 2014-12-14
• [Presentation] Oncolytic plasmid system; a novel antitumor strategy by plasmids encoding pathogenic antigens blocking the immune escape of tumor (2014)
  • Author(s): Koyama Y, Ushigusa T, Inaba T, Sugiura K, Eriguchi M, Ito T.
  • Organizer: The 22th Meeting of the European Society of Gene and Cell Therapy
  • Place of Presentation: Hague (Netherlands)
  • Year and Date: 2014-10-23 – 2014-10-26
• [Presentation] 再生獣医療法の展望―新技術がもたらす可能性と課題―イヌiPS細胞由来の血小板の作出 (2014)
  • Author(s): 稲葉俊夫
  • Organizer: ワクチンバイオ医薬品研究会第5回総会・シンポジウム
  • Place of Presentation: 北海道大学（北海道・札幌市）
  • Year and Date: 2014-09-11 – 2014-09-11
  • Invited
• [Presentation] 成犬体細胞からのiPS細胞樹立の試み (2014)
  • Author(s): 三埜晃佑、西村俊哉、鳩谷晋吾、杉浦喜久弥、今井 裕、高橋正弘、川手憲俊、玉田尋通、稲葉俊夫
  • Organizer: 第157回日本獣医学会学術集会
  • Place of Presentation: 北海道大学（北海道・札幌市）
  • Year and Date: 2014-09-09 – 2014-09-12
• [Presentation] センダイウイルスベクター（SeVdp）を用いたネコおよびイヌiPS細胞の作製 (2014)
  • Author(s): 淀江京平、鳩谷晋吾、金城凌二、杉浦喜久弥、大高真奈美、西村健、中西真人、高橋正弘、川手憲俊、玉田尋通、稲葉俊夫
  • Organizer: 第157回日本獣医学会学術集会
  • Place of Presentation: 北海道大学（北海道・札幌市）
  • Year and Date: 2014-09-09 – 2014-09-12
• [Presentation] ラット精巣のテストステロン産生に及ぼすLepidium meyenii（マカ）の影響 (2014)
  • Author(s): 太田祥弘、吉田圭佑、神谷聡、川手憲俊、高橋正弘、稲葉俊夫、鳩谷晋吾、森井浩子、高橋勝美、井藤美咲、小川 博、玉田尋通
  • Organizer: 第157回日本獣医学会学術集会
  • Place of Presentation: 北海道大学（北海道・札幌市）
  • Year and Date: 2014-09-09 – 2014-09-12
• [Presentation] 体外培養時における機械的振動がウシ胚の発生に及ぼす影響 (2014)
  • Author(s): 本田龍駿、高橋正弘、鳩谷晋吾、稲葉俊夫、川手憲俊、玉田尋通
  • Organizer: 第157回日本獣医学会学術集会
  • Place of Presentation: 北海道大学（北海道・札幌市）
  • Year and Date: 2014-09-09 – 2014-09-12
• [Presentation] マウス内臓腫瘍転移モデルにおける抗腫瘍免疫反応を増強した樹状細胞療法の治療効果の検討 (2014)
  • Author(s): 太田敦子、杉浦喜久弥、赤澤隆、Wijewardana Viskam、Wijesekera Dalthgamage Pathy、今本茂樹、鳩谷晋吾、井上徳光、稲葉俊夫
  • Organizer: 第157回日本獣医学会学術集会
  • Place of Presentation: 北海道大学（北海道・札幌市）
  • Year and Date: 2014-09-09 – 2014-09-12
• [Presentation] Derivation of naive-type induced pluripotent stem cells in cattle using piggyBac transposition of doxycycline-inducible transcription factors (2014)
  • Author(s): Kawaguchi T, Tsukiyama T, Minami N, Yamada M, Matsuyama S, Kimura K, Imai H.
  • Organizer: World Congress on Reproductive Biology (WCRB)
  • Place of Presentation: Edinburgh (Scotland)
  • Year and Date: 2014-09-02 – 2114-09-04
• [Presentation] piggyBacトランスポゾンを用いたリプログラミング因子導入によるウシ羊膜細胞からの栄養膜細胞株樹立の試み (2014)
  • Author(s): 川口 高正、築山智之、松山 秀一、木村 康二、南 直治郎、山田 雅保、今井 裕
  • Organizer: 第107回日本繁殖生物学会大会
  • Place of Presentation: 帯広畜産大学（北海道・帯広市）
  • Year and Date: 2014-08-21 – 2014-08-24
• [Presentation] イエネコ体細胞を用いたリプログラミング誘導に関する研究 (2014)
  • Author(s): 古田侑吾、川口高正、南 直治郎、山田雅保、稲葉俊夫、今井 裕
  • Organizer: 第107回日本繁殖生物学会大会
  • Place of Presentation: 帯広畜産大学（北海道・帯広市）
  • Year and Date: 2014-08-21 – 2014-08-24
• [Presentation] Expression analyses of insulin-like peptide 3 and its receptor, RXFP2, in testes of normal and cryptorchid dogs (2014)
  • Author(s): Hannan MA, Kubo Y, Pathirana IN, Bullesbach EE, Takahashi M, Tamada T, Hatoya S, Inaba T, Kawate N.
  • Organizer: The 9th Biennual Meeting of the Association for Applied Animal Andrology
  • Place of Presentation: Newcastle, Australia
  • Year and Date: 2014-08-08 – 2014-08-10
• [Book] iPS細胞の樹立と細胞分化、「哺乳動物の発生工学」佐藤英明ら編 (2014)
  • Author(s): 今井 裕
  • Total Pages: 212
  • Publisher: 朝倉書店
• [Remarks] Laboratory of Cell Pathobiology
  • URL: http://www.vet.osakafu-u.ac.jp/cellE/cellE.html