Development of basic technologies for cell therapy using ES and iPS cells for blood diseases in dogs

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 24380172
• Research Institution: Osaka Prefecture University
• Principal Investigator: 稲葉 俊夫 大阪府立大学, 生命環境科学研究科(系), 教授 (00137241)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 今井 裕 京都大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (10303869) ; 杉浦 喜久弥 大阪府立大学, 生命環境科学研究科(系), 准教授 (30171143) ; 鳩谷 晋吾 大阪府立大学, 生命環境科学研究科(系), 准教授 (40453138) ; 玉田 尋通 大阪府立大学, 生命環境科学研究科(系), 教授 (10155252) ; 川手 憲俊 大阪府立大学, 生命環境科学研究科(系), 准教授 (80221901) ; 谷 浩行 大阪府立大学, 生命環境科学研究科(系), 准教授 (00305658)
• Project Period (FY): 2012-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 再生医療 / 統合動物科学 / ES細胞 / iPS細胞 / バイオテクノロジー / イヌ

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、ヒトと共通の疾病が自然発症するイヌに着眼し、ヒト再生医療の実用化を円滑に進め得るトランスレーショナルリサーチの一つとして、イヌ胚性幹細胞（ES細胞）および人工多能性幹細胞（iPS細胞）の血液系再生医療に向けた応用的基盤技術の開発を目的としている。本研究年度では、昨年度に作製した人工胚体外内胚葉細胞様細胞(iXEN様細胞)を用いてその特性解析、および細胞質内で遺伝子を複製することができるセンダイウイルスベクター(SeVdp)を用いる安全な多能性幹細胞の作製について検討し、以下の結果を得た。
１．イヌ胎子線維芽細胞にドキシサイクリン誘導性レンチウイルスベクターを用い4つの多能性関連遺伝子（OCT3/4、SOX2、KLF4、およびc-MYC）を導入後、p38阻害剤、トランスフォーミング増殖因子(TGF)β1阻害剤などの低分子化合物の存在下で培養して作製したイヌiXEN様細胞は立体的なコロニーを形成し、継代を重ねると、扁平でタイル状の形態を示し、50継代以上まで維持できた。本細胞は免疫調節能および多能性を有することが示唆された。
２．SeVdpを用いてイヌiXEN様細胞の作製を試みたところ、同様の性質を有する細胞が得られ、本細胞はSeVdpの発現が消失していたことから、遺伝子組換えの無いイヌiXEN様細胞が作製できた。
３．ネコ胎子線維芽細胞にSeVdpを用いて、従来の4つの多能性関連遺伝子とヒトNANOGおよびLIN28 を加えた6因子を導入後、体細胞の初期化を促進する作用を持つTGFβ阻害剤であるA83-01、塩基性線維芽細胞成長因子、およびForskolinを培地中に添加することにより、SeVdp除去後においても長期継代が可能なネコiPS細胞株を作製することができた。

Research Progress Status

28年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

28年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Feeder-independent canine induced pluripotent stem cells maintained under serum-free conditions (2017)
  • Author(s): Nishimura T, Hatoya S, Kanegi R, Wijesekera DPH, Sanno K, Tanaka E, Sugiura K, Kawate N, Tamada H, Imai H, Inaba T.
  • Journal Title: Molecular Reproduction and Development Volume: 84 Pages: 329-339
  • DOI: 10.1002/mrd.22789
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Generation of canine induced extraembryonic endoderm-like cell line that forms both extraembryonic and embryonic endoderm derivatives (2017)
  • Author(s): Nishimura T, Unezaki N, Kanegi R, Wijesekera DPH, Hatoya S, Sugiura K, Kawate N, Tamada H, Imai H, Inaba T.
  • Journal Title: Stem Cells and Development Volume: 印刷中 Pages: 印刷中
  • DOI: 10.1089/scd.2017.0026
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Production of feline leukemia inhibitory factor (LIF) with biological activity in Escherichia coli (2016)
  • Author(s): Kanegi R, Hatoya S, Tsujimoto Y, Takenaka S, T. Nishimura T, Wijewardana V, Sugiura K, Takahashi M, Kawate N, Tamada H, Inaba T.
  • Journal Title: Theriogenology Volume: 86 Pages: 604-611
  • DOI: 10.1016/j.theriogenology.2016.02.013
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Methylprednisolone sodium succinate reduces spinal cord swelling, but has no effect of recovery in dogs with surgically treated intervertebral disc herniation (2016)
  • Author(s): Nishida H, Tanaka H, Kitamura M, Inaba T, Nakayama M.
  • Journal Title: Japanease Journal of Veterinary Research Volume: 64 Pages: 191-196
  • DOI: 10.14943/jjvr.64.3.191
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Exosomes derived from tumor cells genetically modified to express Mycobacterium tuberculosis antigen: a novel vaccine for cancer therapy (2016)
  • Author(s): Koyama Y, Ito T, Hasegawa A, Eriguchi M, Inaba T, Ushigusa T, Sugiura K.
  • Journal Title: Biotechnology Letters Volume: 38 Pages: 1857-1866
  • DOI: 10.1007/s10529-016-2185-1
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] "Artificial neoepitope"- bearing exosomes as novel vaccine for cancer immunotherapy (2016)
  • Author(s): Koyama Y, Ito T, Inaba T, Sugiura K.
  • Organizer: 第45回日本免疫学会学術集会
  • Place of Presentation: 沖縄コンベンションセンター(沖縄県宜野湾市)
  • Year and Date: 2016-12-05 – 2016-12-07
• [Presentation] 「人口ネオエピトープ」を担持した腫瘍由来エクソソームによるガン免疫治療 (2016)
  • Author(s): 小山義之、伊藤智子、長谷川綾、杉浦喜久弥、稲葉俊夫、江里口正純
  • Organizer: 第3回日本細胞外小胞学会
  • Place of Presentation: グランドプリンスホテル広島(広島県広島市)
  • Year and Date: 2016-09-06 – 2016-09-08
• [Presentation] 結核菌抗原遺伝子を用いた腫瘍治療メカニズムの解明 (2016)
  • Author(s): 長谷川綾、牛草貴博、小山義之、伊藤智子、鳩谷晋吾、杉浦喜久弥、稲葉俊夫
  • Organizer: 第159回日本獣医学会学術集会
  • Place of Presentation: 日本大学生物資源科学部（神奈川県藤沢市）
  • Year and Date: 2016-09-06 – 2016-09-08
• [Presentation] ネコiPS細胞株のセンダイウイルスベクターを用いた作製 (2016)
  • Author(s): 沖田良太、鳩谷晋吾、杉浦喜久弥、大高真奈美、西村健、中西真人、稲葉俊夫
  • Organizer: 第159回日本獣医学会学術集会
  • Place of Presentation: 日本大学生物資源科学部（神奈川県藤沢市）
  • Year and Date: 2016-09-06 – 2016-09-08
• [Presentation] ウシ卵子の体外成熟培養時におけるMAPKK阻害剤(U0126)添加の胚発生に及ぼす影響 (2016)
  • Author(s): 篠原健志、太田祥弘、川手憲俊、高橋正弘、坂上信忠、稲葉俊夫、玉田尋通
  • Organizer: 第159回日本獣医学会学術集会
  • Place of Presentation: 日本大学生物資源科学部（神奈川県藤沢市）
  • Year and Date: 2016-09-06 – 2016-09-08
• [Presentation] イヌ体細胞を用いた人工誘導胚体外内胚葉細胞の作製と肝細胞への分化誘導 (2016)
  • Author(s): 畦﨑直哉、西村俊哉、金城綾二、Wijesekera DPH、鳩谷晋吾、杉浦喜久弥、川手憲俊、玉田尋通、今井裕、稲葉俊夫
  • Organizer: 第159回日本獣医学会学術集会
  • Place of Presentation: 日本大学生物資源科学部(神奈川県藤沢市)
  • Year and Date: 2016-09-06 – 2016-09-08
• [Presentation] Manipulation of tumor microenvironment by cytokine gene transfection enhances dendritic cell-based immunotherapy (2016)
  • Author(s): Wijesekera DPH, Sugiura K, Ichida C, Yuba E, Kono K, Yamate J, Kanegi R, Nishimura T, Nadeeka HD, Hatoya S, Inaba T.
  • Organizer: ICI 2016-International Congress of Immunology 2016
  • Place of Presentation: Melbourne Convention and Exhibition Centre (Melbourne, Australia)
  • Year and Date: 2016-08-31 – 2016-09-02
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Effects of long-acting GnRH antagonist on plasma insulin-like peptide 3 and testosterone concentraions and scrotal circumference in mage goats (2016)
  • Author(s): Kawate N, Hannan MA, Fukami Y, Weerakoon WWPN, Bullesbach EE, Inaba T, Tamada H.
  • Organizer: 18th International Congress of Animal reproducion
  • Place of Presentation: Le Vinci (Tours, France)
  • Year and Date: 2016-06-26 – 2016-06-30
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Generation of multipotent canine extraembryonic endoderm-like cells via the formation of induced pluripotent stem cells. (2016)
  • Author(s): Unezaki N, Nishimura T, Kanegi R, Wijesekera D.P.H., Hatoya S, Sugiura K, Kawate N, Tamada H, Imai H, Inaba T.
  • Organizer: The International Society for Stem Cell Research (ISSCR) 14th Annual Meeting
  • Place of Presentation: Moscone West（San Francisco, USA）
  • Year and Date: 2016-06-22 – 2016-06-25
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] "Artificial neoepitope"- bearing exosomes derived from tumor cells being genetically modified to express Mycobacterium tuberculosis antigen: a novel vaccine for cancer therapy (2016)
  • Author(s): Koyama Y, Ito T, Eriguchi M, Hasegawa A, Inaba T, Sugiura K.
  • Organizer: The 5th Annual Meeting of the International Society for Extracellular Vesicles
  • Place of Presentation: De Doelen Concert and Congress Center （Rotterdam, Netherlands）
  • Year and Date: 2016-05-04 – 2016-05-07
  • Int'l Joint Research
• [Remarks] Laboratory of Cell Pathobiology
  • URL: http://www.vet.osakafu-u.ac.jp/english/cell/
• [Patent(Industrial Property Rights)] イヌ人工誘導胚体外内胚葉細胞様株の作製方法 (2016)
  • Inventor(s): 稲葉俊夫、西村俊哉、畦﨑直哉、鳩谷晋吾、杉浦喜久弥
  • Industrial Property Rights Holder: 大阪府立大学
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: 特願2016-116612
  • Filing Date: 2016-06-10