2014 Fiscal Year Annual Research Report
| Project/Area Number |
24390107
|
|---|
| Research Institution | Osaka City University |
|---|
Principal Investigator |
宮田 真人 大阪市立大学, 大学院理学研究科, 教授 (50209912)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2016-03-31
|
| Keywords | 細胞運動 / 電子顕微鏡 / 一分子計測 / 寄生細菌 / 構造生物学 / 電子線 / 急速レプリカ法 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
2011年と2012年の冬に世界的に大流行した“マイコプラズマ肺炎”は，マイコプラズマという細菌によって起こる．マイコプラズマは，全くユニークなメカニズムで宿主表面を滑走運動する．申請者は，これまで主に最速種のMycoplasma mobile（マイコプラズマ・モービレ）を用いて，滑走装置とその構成タンパク質などを明らかにし，今まさにメカニズムの本質に迫ろうとしている．現在提案しているモデルは，以下である．すなわち，「滑走装置は4種類の新規巨大タンパク質から形成されており，ユニークな細胞骨格構造により支えられている．滑走装置からは長さ50ナノメートルのやわらかい“あし”が多数つきだしている．ATPの加水分解により装置に動きが生じ，“あし”のタンパク質が宿主細胞表面などのシアル酸オリゴ糖をつかんだり，ひっぱったり，はなしたりして，滑走運動が起こる．」さらに，本研究ではモービレの研究で培った技術と知識を全く異なるタンパク質により滑走する，Mycoplasma pneumoniae（マイコプラズマ・ニューモニエ）に適用し，その運動メカニズムをも明らかにする．本年度は，1. 滑走装置の三次元電子顕微鏡像解析，2. 滑走に必須なタンパク質の構造解析，3. “あし”動きの検出と解析，4. 遺伝子操作による滑走装置の構造解析，を行い，それぞれ次項に記載する結果を得た．
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究実績の概要にあげたそれぞれの項目を以下の様に展開した．1. 滑走装置の三次元電子顕微鏡像解析：モービレの“滑走装置”の単離に成功し，表面構造と内部構造のそれぞれに注目した形での構造解析を行った．電子線クライオトモグラフィー（ECT）を用いた解析を行い，モーター部分の詳細な構造とATP加水分解に伴う構造変化，モーターから菌体表面の“あし”へのつながり，各部分の正確な大きさなどを明らかにした．また，ニューモニエ滑走装置の内部構造についても，より解像度の高い像を得ることに成功した．2. 滑走に必須なタンパク質の構造解析：モービレにおいて装置内部と菌体表面をつなぐタンパク質を同定した．マイコプラズマ両種の，滑走に必須なタンパク質，計６種の組換えタンパク質発現，精製を行い，３種については詳細な構造解析に成功した．3. “あし”動きの検出と解析：モービレの滑走時の動きと発生する力を，ビーズ，蛍光ラベル，光ピンセットなどを組み合わせた系を用いることで詳細に解析し，ひとつの“あし”の動きと力発生を捉えることに成功した．また単一のシアル酸オリゴ糖（SO）をコートしたプラスチックアレイを用いることでSOの認識方法を明らかにした．4. 遺伝子操作による滑走装置の構造解析：前年度に開発したモービレにおける遺伝子操作の系を用いることで，７つの滑走タンパク質の存在位置を明らかにしつつある．
|
| Strategy for Future Research Activity |
研究実績の概要にあげたそれぞれの項目を以下の様に進展させる．1. 滑走装置の三次元電子顕微鏡像解析：ネガティブ染色電子顕微鏡法と高速原子間力顕微鏡（AFM）を併用した解析を行い，前年度までにETCを用いて明らかにした構造の滑走時における変化を明らかにして滑走運動メカニズムの本質に迫る．2. 滑走に必須なタンパク質の構造解析：組換えタンパク質として得られた“あし”タンパク質のリガンドであるシアル酸オリゴ糖との結合活性を，光ピンセットと原子間力顕微鏡で引き続き解析する．また組換えタンパク質に変異を導入し，結合活性に必要な構造を調べる．現在行っている電子顕微鏡および結晶化による構造解析を完成する．3. “あし”動きの検出と解析： “あし”や滑走装置内部構造を遺伝子操作，抗体，電荷など様々な方法をもちいて，金粒子や蛍光で標識する．これらの標識を光学顕微鏡で追跡することで，滑走時における動きを可視化する．4. 遺伝子操作による滑走装置の構造解析：これまでに滑走装置に存在することが蛍光顕微鏡などで示されている約20種のタンパク質の滑走装置中における位置を，タンパク質やタグとの融合を用いて，電子顕微鏡像上で明らかにする．さらにこれまでモービレやニューモニエでは不可能とされている相同組み換え法を開発し，様々な変異を導入することで，可能性のあるメカニズムを検証する．
|
| Causes of Carryover |
滑走に必須なタンパク質の結晶について回折像撮影を行ったところ，それらの回折像からでは高解像度の立体構造構築が予想外に困難なことが判明した．その結果，タンパク質の構造に新たな改変を加え，タンパク質精製と結晶作製の条件検討を再度行う必要が生じた．
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
結晶作製のための消耗品70万円と，タンパク質の構造を改変するために必要なDNA合成と解析に必要な受託費用30万円．
|
