病理学の最新テクノロジーを応用した漢方薬の薬効・機能解析法の確立

2013 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 24390181
• Research Institution: University of Toyama
• Principal Investigator: 常山 幸一 富山大学, 大学院医学薬学研究部(医学), 准教授 (10293341)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 藤本 誠 富山大学, 大学病院, 講師 (30377337) ; 平 修 福井県立大学, 生物資源学部, 准教授 (30416672)
• Project Period (FY): 2012-04-01 – 2015-03-31
• Keywords: メタボリックシンドローム / NASH / 動物モデル / 漢方薬 / 質量顕微鏡

Research Abstract

メタボリックシンドローム（MetS）の肝での表現型であるNAFLD/NASH は21 世紀の肝臓病とも呼ばれ、先進諸国で患者数が急増している。世界中で有効な予防法や治療法が研究されているが、いまだ有効な薬物は確立されていない。我々は、漢方薬や生薬は食に近く安全に長期摂取が可能であり、MetS やNASH の予防的投与に最適な薬物と考えている。本研究では、独自に開発したMetS・NASH モデルマウスを用い、真に有効な漢方薬や構成生薬をエビデンスに基づいて多角的に探索する。また、生薬に含まれる種々の低分子化合物の局在を細胞レベルで可視化できる新技術（質量顕微鏡）を応用し、動物モデルの各臓器における化合物・代謝産物の局在を明らかにする。また、それら化合物が直接コンタクトしている標的細胞を同定し、薬剤の作用機序の解明を試みる。これまでに、ICR-MSGマウスやTSODマウス、高脂肪食投与マウスなど、複数のMtS-NASHモデル動物を用いて、種々の漢方薬による病態抑制効果とそのメカニズムを経時的に検討してきた。その結果、桂枝茯苓丸や防已黄耆湯などの漢方薬や、紅麹、フィコシアニン、エイコサペンタエン酸などの天然薬物、サプリメントに、優れた抗MtS効果がある事が明らかとなった。なかでも、防已黄耆湯は、複数の疾患モデル動物で共通した効果（脂肪細胞炎症抑制効果、脂質代謝改善効果）を示しており、マクロファージへの直接作用が想定される基礎実験結果も蓄積されている。
低分子物質の質量顕微鏡解析については、技術的な予備検討を重ね、鉄をコアにしたナノ粒子のアシストによって、2オクチン酸などの低分子物質をイオン化することに成功した。現在、コア成分をCr, Mn, Coの酸化物などに変更した種々のナノ粒子を用い、それぞれの低分子化合物のイメージングに最も適した組み合わせを検討している。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

異なる機序に基づき、ヒトに近い病理組織像を呈するMetS-NASH-発癌モデルを用いた検討を継続し、漢方薬では防已黄耆湯の高い抗MetS効果を新たに見出すことに成功した。また、高コレステロールと高脂肪食の組み合わせにより、肝線維化が著明に亢進する事を見出し、新しく開発したMetS-NASHモデルの肝臓におけるコレステロール局在を質量顕微鏡でイメージングすることに成功した（国際誌採択済）。現在、各種脂肪酸のMetSやNASHにおける役割を質量顕微鏡を用いて解析中であり、有望な結果が得られつつある。
また、標的とする低分子化合物に最適なナノ粒子コア物質を用いる事で、より高感度の質量顕微鏡解析が可能になり、in vivoでの実験系を用いた漢方薬・生薬の含有成分や代謝産物のイメージングに向けて、技術的基盤が整った。

Strategy for Future Research Activity

本年度は、これまでの知見を集積し、防已黄耆湯に含まれる低分子化合物を標的に、その局在を内臓脂肪、膵臓、肝臓、など臓器別に明らかにする。また、これら臓器の連続切片を用いて、低分子化合物の局在と関連しうる解剖学的特徴や特異的な細胞分布などを明らかにする。我々は最近、DIAR系マウスの新生児期にMSG処置をして誘導する獲得型メタボリックシンドローム解析モデル“DIAR-MSG マウス”が、従来のICR系を用いたMSGマウスよりも、よりヒトに類似した病理組織所見を呈する事を報告した。DIAR-MSGマウスは、肥満、糖尿病、高脂血症を経て脂肪性肝炎~肝細胞癌を発症するヒトに近い疾患自然史を有し、各臓器の病理組織像も極めてヒトに類似していることから、現時点で、ヒトへのトランスレーションに最も適したなモデル動物の１つと考えられる。本年度の研究は、従来用いていたICR-MSGではなく、DIAR-MSGマウスを用いて行う。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

これまで独自に開発してきたMetS-NASHモデル動物（TSODマウスやDIAR-MSGマウスなど）にちて積極的に国内外の学会や学術誌で報告を行った結果、これらのモデル動物が様々な研究機関でも使用されることとなり、多くの共同研究に発展した。その結果、外部の機関が動物実験を担当し、臓器等を採取後に病理組織学的解析や質量顕微鏡解析を我々が淡ようする形態の共同研究が増加した。病理学的解析は動物実験終了後、臓器を採取してからスタートするため、昨年度行った動物実験の多くは、解析が引き続く年度に行われることとなる。今回、動物実験に必要と考えていた研究費は減少することとなったが、今後は逆に病理学的解析や質量顕微鏡解析の費用が増加する見込みである。
東証に計画していた実験内容に加え、昨年度に会した多施設との共同研究において、病理学的解析、質量顕微鏡による解析の費用が増加する事が見込まれるため、追加検討に係る費用として繰り越された金額を充当する。

Research Products

• [Journal Article] Involvement of immune- and inflammatory-related factors in flucloxacillin-induced liver injury in mice. (2014)
  • Author(s): Takai S, Higuchi S, Yano A, Tsuneyama K, Fukami T, Nakajima M, Yokoi T.
  • Journal Title: J Appl Toxicol. Volume: 35 Pages: 142-151
  • DOI: 10.1002/jat.3002.
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Distinct from its canonical effects, deletion of IL-12p40 induces cholangitis and fibrosis in interleukin-2Rα(-/-) mice. (2014)
  • Author(s): Yao Y, Yang W, Yang YQ, Ma HD, Lu FT, Li L, Tao YY, Tsuneyama K, Zhang W, Friedman S, Gershwin ME, Lian ZX.
  • Journal Title: J Autoimmun. Volume: 51 Pages: 99-108
  • DOI: 10.1016/j.jaut.2014.02.009.
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Splenic lymph follicles generate immunoglobulin M-producing B cells in primary biliary cirrhosis. (2014)
  • Author(s): Kikuchi K, Tsuneyama K, Yamada H, Kajiyama Y, Matsumoto K, Tsunashima H, Yamashita R, Takai A, Negishi M, Hara M, Moritoki Y, Miyakawa H.
  • Journal Title: Hepatol Res. Volume: in press Pages: in press
  • DOI: 10.1111/hepr.12231
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Escherichia coli infection induces autoimmune cholangitis and anti-mitochondrial antibodies in non-obese diabetic (NOD).B6 (Idd10/Idd18) mice. (2014)
  • Author(s): Wang JJ, Yang GX, Zhang WC, Lu L, Tsuneyama K, Kronenberg M, Véla JL, Lopez-Hoyos M, He XS, Ridgway WM, Leung PS, Gershwin ME
  • Journal Title: Clin Exp Immunol. Volume: 175(2) Pages: 192-201
  • DOI: 10.1111/cei.12224
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Involvement of oxidative stress and immune- and inflammation-related factors in azathioprine-induced liver injury. (2014)
  • Author(s): Matsuo K, Sasaki E, Higuchi S, Takai S, Tsuneyama K, Fukami T, Nakajima M, Yokoi T.
  • Journal Title: Toxicol Lett Volume: 224(2) Pages: 215-24
  • DOI: 10.1016/j.toxlet.2013.10.025.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Reversible phospho-Smad3 signalling between tumour suppression and fibrocarcinogenesis in chronic hepatitis B infection. (2014)
  • Author(s): 10: Deng YR, Yoshida K, Jin QL, Murata M, Yamaguchi T, Tsuneyama K, Moritoki Y, Niu JQ, Matsuzaki K, Lian ZX.
  • Journal Title: Clin Exp Immunol. Volume: 176(1) Pages: 102-11
  • DOI: 10.1111/cei.12259
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] IL-12/Th1 and IL-23/Th17 biliary microenvironment in primary biliary cirrhosis: Implications for therapy. (2014)
  • Author(s): Yang CY, Ma X, Tsuneyama K, Huang S, Takahashi T, Chalasani NP, Bowlus CL, Yang GX, Leung PS, Ansari AA, Wu L, Coppel RL, Gershwin ME.
  • Journal Title: Hepatology Volume: in press Pages: in press
  • DOI: 10.1002/hep.26979
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Histopathological analysis for osteomalacia and tubulopathy in itai-itai disease. (2014)
  • Author(s): Baba H, Tsuneyama K, Kumada T, Aoshima K, Imura J.
  • Journal Title: J Toxicol Sci Volume: 39(1) Pages: 91-6
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Introduction and utility of liquid-based cytology on aspiration biopsy of peripheral nodular lesions of the lung. (2014)
  • Author(s): Imura J, Abe K, Uchida Y, Shibata M, Tsunematsu K, Sathoh M, Miwa S, Nakajima T, Nomoto K, Hayashi S, Tsuneyama K.
  • Journal Title: Oncol Lett. Volume: 7(3) Pages: 669-673
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A simple and rapid decalcification procedure of skeletal tissues for pathology using an ultrasonic cleaner with D-mannitol and formic acid. (2014)
  • Author(s): Hatta H, Tsuneyama K, Nomoto K, Hayashi S, Miwa S, Nakajima T, Nishida T, Nakanishi Y, Imura J.
  • Journal Title: Acta Histochem. Volume: in press Pages: in press
  • DOI: 10.1016/j.acthis.2014.01.006
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A Dietary Restriction Influences the Progression But Not the Initiation of MSG-Induced Nonalcoholic Steatohepatitis. (2014)
  • Author(s): ujimoto M, Tsuneyama K, Nakanishi Y, Salunga TL, Nomoto K, Sasaki Y, Iizuka S, Nagata M, Suzuki W, Shimada T, Aburada M, Shimada Y, Gershwin ME, Selmi C.
  • Journal Title: J Med Food. Volume: 17(3) Pages: 374-83
  • DOI: 10.1089/jmf.2012.0029.
• [Journal Article] Social Isolation Stress-Induced Fear Memory Deficit is Mediated by Down-Regulated Neuro-Signaling System and Egr-1 Expression in the Brain. (2014)
  • Author(s): Okada R, Matsumoto K, Tsushima R, Fujiwara H, Tsuneyama K.
  • Journal Title: Neurochem Res. Volume: in press Pages: in press
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Molecular mechanisms of hyperthermia-induced apoptosis enhanced by docosahexaenoic acid: Implication for cancer therapy. (2014)
  • Author(s): Cui ZG, Piao JL, Kondo T, Ogawa R, Tsuneyama K, Zhao QL, Feril LB Jr, Inadera H.
  • Journal Title: Chem Biol Interact Volume: in press Pages: in press
  • DOI: 10.1016/j.cbi.2014.03.005
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Neonatal MSG Treatment Causes Obesity, Diabetes, and Macrovesicular Steatohepatitis with Liver Nodules in DIAR Mice (2014)
  • Author(s): Tsuneyama K, Nishida T, baba H, Taira S, Fujimoto m, Nomoto K, Hayashi S, Miwa S, Nakajima T, Sutoh M, Oda M, Hokao R, Imura J.
  • Journal Title: Journal of Gastroenterol Hepatol Volume: in press Pages: in press
• [Journal Article] Induction of receptor for advanced glycation end products by insufficient leptin action triggers pancreatic β-cell failure in type 2 diabetes. (2013)
  • Author(s): Han D, Yamamoto Y, Munesue S, Motoyoshi S, Saito H, Win MT, Watanabe T, Tsuneyama K, Yamamoto H
  • Journal Title: Genes Cells Volume: 18(4) Pages: 302-14
  • DOI: 10.1111/gtc.12036
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Adipose tissue hypoxia induces inflammatory M1 polarity of macrophages in an HIF-1α-dependent and HIF-1α-independent manner in obese mice. (2013)
  • Author(s): Fujisaka S, Usui I, Ikutani M, Aminuddin A, Takikawa A, Tsuneyama K, Mahmood A, Goda N, Nagai Y, Takatsu K, Tobe K.
  • Journal Title: Diabetologia Volume: 56(6) Pages: 1403-12
  • DOI: 10.1007/s00125-013-2885-1
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Phosphorylated Smad2 and Smad3 signaling: Shifting between tumor suppression and fibro-carcinogenesis in chronic hepatitis C. (2013)
  • Author(s): Yamaguchi T, Matsuzaki K, Inokuchi R, Kawamura R, Yoshida K, Murata M, Fujisawa J, Fukushima N, Sata M, Kage M, Nakashima O, Tamori A, Kawada N, Tsuneyama K, Dooley S, Seki T, Okazaki K.
  • Journal Title: Hepatol Res Volume: 43(12) Pages: 1327-42
  • DOI: 10.1111/hepr.12082
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Clonality, activated antigen-specific CD8(+) T cells, and development of autoimmune cholangitis in dnTGFβRII mice. (2013)
  • Author(s): Kawata K, Yang GX, Ando Y, Tanaka H, Zhang W, Kobayashi Y, Tsuneyama K, Leung PS, Lian ZX, Ridgway WM, Ansari AA, He XS, Gershwin ME.
  • Journal Title: Hepatology Volume: 58(3) Pages: 1094-104
  • DOI: 10.1002/hep.26418
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] The liver in itai-itai disease (chronic cadmium poisoning): pathological features and metallothionein expression. (2013)
  • Author(s): Baba H, Tsuneyama K, Yazaki M, Nagata K, Minamisaka T, Tsuda T, Nomoto K, Hayashi S, Miwa S, Nakajima T, Nakanishi Y, Aoshima K, Imura J.
  • Journal Title: Mod Pathol Volume: 26(9) Pages: 1228-34
  • DOI: 10.1038/modpathol.2013.62
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Situs inversus and cystic kidney disease: Two adult patients with this Heterogeneous syndrome. (2013)
  • Author(s): Onoe T, Konoshita T, Tsuneyama K, Hamano R, Mizushima I, Kakuchi Y, Yamada K, Hayashi K, Kuroda M, Kagitani S, Nomura H, Yamagishi M, Kawano M.
  • Journal Title: Am J Case Rep. Volume: 14 Pages: 20-5
  • DOI: 10.12659/AJCR.883751
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Eicosapentaenoic acid attenuates hepatic accumulation of cholesterol esters but aggravates liver injury and inflammation in mice fed a cholate-supplemented high-fat diet. (2013)
  • Author(s): Watanabe S, Tsuneyama K.
  • Journal Title: J Toxicol Sci Volume: 38(3) Pages: 379-90
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Phycocyanin prevents hypertension and low serum adiponectin level in a rat model of metabolic syndrome. (2013)
  • Author(s): Ichimura M, Kato S, Tsuneyama K, Matsutake S, Kamogawa M, Hirao E, Miyata A, Mori S, Yamaguchi N, Suruga K, Omagari K.
  • Journal Title: Nutr Res Volume: 33(5) Pages: 397-405
  • DOI: 10.1016/j.nutres.2013.03.006
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Studies of efficacy and liver toxicity related to adeno-associated virus-mediated RNA interference. (2013)
  • Author(s): Sun CP, Wu TH, Chen CC, Wu PY, Shih YM, Tsuneyama K, Tao MH.
  • Journal Title: Hum Gene Ther Volume: 24(8) Pages: 739-50
  • DOI: 10.1089/hum.2012.239
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Autoimmune features in metabolic liver disease: a single-center experience and review of the literature. (2013)
  • Author(s): Tsuneyama K, Baba H, Kikuchi K, Nishida T, Nomoto K, Hayashi S, Miwa S, Nakajima T, Nakanishi Y, Masuda S, Terada M, Imura J, Selmi C.
  • Journal Title: Clin Rev Allergy Immunol. Volume: 45(1) Pages: 143-8
  • DOI: 10.1007/s12016-013-8383-x
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] STAT3-mediated attenuation of CCl4-induced mouse liver fibrosis by the protein kinase inhibitor sorafenib. (2013)
  • Author(s): Deng YR, Ma HD, Tsuneyama K, Yang W, Wang YH, Lu FT, Liu CH, Liu P, He XS, Diehl AM, Gershwin ME, Lian ZX.
  • Journal Title: J Autoimmun. Volume: 46 Pages: 25-34
  • DOI: 10.1016/j.jaut.2013.07.008
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Anti-CD40 ligand monoclonal antibody delays the progression of murine autoimmune cholangitis. (2013)
  • Author(s): Tanaka H, Yang GX, Iwakoshi N, Knechtle SJ, Kawata K, Tsuneyama K, Leung P, Coppel RL, Ansari AA, Joh T, Bowlus C, Gershwin ME.
  • Journal Title: Clin Exp Immunol Volume: 174(3) Pages: 364-71
  • DOI: 10.1111/cei.12193
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A novel mouse model for phenytoin-induced liver injury: involvement of immune-related factors and P450-mediated metabolism. (2013)
  • Author(s): Sasaki E, Matsuo K, Iida A, Tsuneyama K, Fukami T, Nakajima M, Yokoi T.
  • Journal Title: Toxicol Sci. Volume: 136(1) Pages: 250-63
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Identification of potential cytokine pathways for therapeutic intervention in murine primary biliary cirrhosis. (2013)
  • Author(s): Kawata K, Tsuda M, Yang GX, Zhang W, Tanaka H, Tsuneyama K, Leung P, He XS, Knechtle S, Ansari AA, Coppel RL, Gershwin ME.
  • Journal Title: PLoS One. Volume: 8(9) Pages: e74225
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0074225
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] IFN-γ deficiency attenuates hepatic inflammation and fibrosis in a steatohepatitis model induced by a methionine- and choline-deficient high-fat diet. (2013)
  • Author(s): Luo XY, Takahara T, Kawai K, Fujino M, Sugiyama T, Tsuneyama K, Tsukada K, Nakae S, Zhong L, Li XK.
  • Journal Title: Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. Volume: 305(12) Pages: G891-9
  • DOI: 10.1152/ajpgi.00193.2013
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Autoimmune Features with Biliary Damages Frequently Overlapped in Old-aged Female Patients of Non-alcoholic Steatohepatitis. (2013)
  • Author(s): 5) Tsuneyama K, Baba H, Nomoto K, Nishida T, Hayashi S, Miwa S, Nakajima T, Nakanishi Y, Imura J.
  • Organizer: 23rd conference of the Asia Pacific Association for the Study of the Liver (APASL)
  • Place of Presentation: Singapole
  • Year and Date: 20130606-20130609
• [Presentation] Neonatal streptozotocin treatment in DIAR mice causes insulin-dependent diabetes mellitus and hepatocellular carcinoma by normal diet. (2013)
  • Author(s): 6) Tsuneyama K, Nishida T, Fujimoto M, Hayashi S, Nomoto K, Miwa S, Nakajima T, Nakanishi Y, Sasaki Y, Nakamura S, Hokao R, Imura J.
  • Organizer: 23rd conference of the Asia Pacific Association for the Study of the Liver (APASL)
  • Place of Presentation: Singapole
  • Year and Date: 20130606-20130609
• [Presentation] DIAR Mice with Neonatal MSG Treatment Showed Macrovesicular Steatosis with Lobular Inflammation and Atypical Nodules in the Liver (2013)
  • Author(s): 7) Tsuneyama K, Nishida T, Nomotro K, Hayashi S, Miwa S, Nakajima T, Nakanishi Y, Sasaki Y, Nakamura S, Hokao R, Imura J.
  • Organizer: 23rd conference of the Asia Pacific Association for the Study of the Liver (APASL)
  • Place of Presentation: Singapole
  • Year and Date: 20130606-20130609
• [Presentation] 新生児期MSG処置DIARマウスは標準食で肥満，糖尿病，及び大滴性脂肪滴を伴うNASHを発症する (2013)
  • Author(s): 18) 常山幸一，西田健志，野本一博，林伸一，三輪重治，中嶋隆彦，中西ゆう子，八田秀樹，井村穣二．
  • Organizer: 第102回日本病理学会総会
  • Place of Presentation: 札幌
  • Year and Date: 20130606-20130608
• [Presentation] 新生児期STZ処置DIARマウスは標準食で1型糖尿病，肝線維化，肝細胞癌を発症する． (2013)
  • Author(s): 19) 常山幸一，西田健志，野本一博，林伸一，三輪重治，中嶋隆彦，中西 ゆう子，八田 秀樹，井村穣二．
  • Organizer: 第102回日本病理 学会総会
  • Place of Presentation: 札幌
  • Year and Date: 20130606-20130608