スプライシング関連遺伝子異常による骨髄異形成症候群の分子病態の解明

2013 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 24390242
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 真田 昌 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (20529044)
• Project Period (FY): 2012-04-01 – 2015-03-31
• Keywords: がん / ゲノム / 遺伝学 / マウスモデル

Research Abstract

骨髄異形成症候群（MDS）においてRNAスプライシングに関わる遺伝子群に高頻度かつ特徴的に後天的な変異が生じていることが明らかとなったが、その分子メカニズムは不明である。細胞株を用いた変異遺伝子の導入実験やウィルスベクターを用いたマウス造血幹細胞への遺伝子導入ならびに、同細胞を用いた骨髄移植実験においては、変異体発現細胞の細胞増殖等における生物学的な優位性は確認されず、また貧血などMDS様の所見も観察されない。そこで、本研究では内因性の発現制御による生理的な発現量で評価を行うために、U2AF1、SF3B1、SRSF2においてはCre-loxPシステムによる変異体のコンディショナル・ノックイン（cKI）マウス、不活化変異が大半を占めるZRSR2についてはコンディショナル・ノックアウトマウスの作成を行った。U2AF1およびSRSF2-cKIマウスについては、Mx-Creマウスとの交配を行い、pIpC投与により、造血細胞特異的に変異アレルが設計通りに発現することが確認をされた。MDSで変異が認められるスプライシング分子は遺伝情報の翻訳過程において重要な機能を担う分子群であるが、造血における機能は明らかではないため、遺伝子変異が最も多く認められるSF3B1を欠失させたマウスの造血系の解析を行った。SF3B1をホモ欠失させた個体は胎生致死であるが、ヘテロ欠失マウスは軽度の骨格異常のみにて生まれる。ヘテロ欠失マウスの末梢血所見においては野生型マウスと差が認められなかったが、骨髄中の造血幹細胞分画は減少し、競合移植実験から野生型マウス由来の造血幹細胞に比し、造血再構築能が低下していることから、造血幹細胞において重要な役割を担っていることが明らかとなった。ただし、SF3B1変異に特徴的な環状鉄芽球をはじめとするMDS様の病態は観察されず、変異アレル特有の効果が必要であると考えられた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

平成25年度までに、計画していたマウスの作成がほぼ終了し、U2AF1およびSRSF2-変異体ノックイン・マウスにおいては、計画通りに変異アレルが誘導的かつ組織特異的に発現することが確認された。後天的な1アミノ酸置換変異に基づく疾患に対する、遺伝学的に正確に再現された動物モデルであると考えられる。残るSF3B1ノックインおよびZRSR2ノックアウト・マウスについても、個体数が確保でき次第、確認を進める。確認が終了しているマウスについては、平成26年度内に詳細な解析が行える状況となっており、ほぼ予定通りに進展していると考える。
また、本研究事業において重要な位置づけにあるRNAシーケンス解析についても、スプライシング変化を同定・比較するための独自のパイプラインの構築も進んでいる。

Strategy for Future Research Activity

完成したマウス系統については、計画通りのアレル組み換えが生じるかを確認の上、C57BL/6マウスとのバッククロスを進め、より正確な解析が可能な個体作出を目指す。十分なバッククロスを行うためには、非常に長い時間を要するため、体外授精（IVF）とマイクロサテライトマーカーを用いた評価を組み合わせて行い、期間の短縮を目指すことで、H26年度内に長期的な観察以外の予定されている研究計画が実施可能である。また、バッククロスに必要な個体数を確保の上で、随時MxCreもしくはVav1-Creマウスと交配させ、バッククロスと並行して予備検討を早期に開始する。造血系の厳密な評価はB6バックグラウンドになってから行うべきであるが、本変異アレルの発現、すなわち後天的な変異の獲得により、腫瘍化ならびにMDS病態に関連する特徴的な兆候が観察されるのか、RNAスプライシングに及ぼす影響、作成したマウスから採取・純化した造血細胞を用いたvitroおよび移植実験を含めたvivoでの評価を重点的に進めていく。

Research Products

• [Journal Article] Somatic RHOA mutation in angioimmunoblastic T cell lymphoma. (2014)
  • Author(s): Sakata-Yanagimoto M, et al, Sanada M, et al. (25/35)
  • Journal Title: Nat Genet Volume: 46 Pages: 171-5
  • DOI: 10.1038/ng.2872
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Haploinsufficiency of Sf3b1 leads to compromised stem cell function but not to myelodysplasia. (2014)
  • Author(s): Matsunawa, M. Yamamoto, R. Sanada, M. Sato-Otsubo, A. Shiozawa, Y. Otsu, M. Isono, K. Koseki, H. Nakauchi, H. Ogawa, S.
  • Journal Title: Leukemia Volume: In press Pages: In press
  • DOI: 10.1038/leu.2014.73
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Landscape of genetic lesions in 944 patients with myelodysplastic syndromes.. (2014)
  • Author(s): Haferlach T, Nagata Y, Grossmann V, Okuno Y, Bacher U, Nagae G, Schnittger S, Sanada M, Kon A, Alpermann T, Yoshida K, Roller A, Nadarajah N, Shiraishi Y, Shiozawa Y, Chiba K, Tanaka H, Koeffler HP, Klein HU, Dugas M, Aburatani H, Kohlmann A, Miyano S, Haferlach C, Kern W, Ogawa S.
  • Journal Title: Leukemia Volume: 28 Pages: 4241-247
  • DOI: 10.1038/leu.2013.336
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Clonal leukemic evolution in myelodysplastic syndromes with TET2 and IDH1/2 mutations. (2014)
  • Author(s): Lin, T. L. Nagata, Y. Kao, H. W. Sanada, M. Okuno, Y. Huang, C. F. Liang, D. C. Kuo, M. C. Lai, C. L. Lee, E. H. Shih, Y. S. Tanaka, H. Shiraishi, Y. Chiba, K. Lin, T. H. Wu, J. H. Miyano, S. Ogawa, S. Shih, L. Y.
  • Journal Title: Haematologic Volume: 99 Pages: 28-36
  • DOI: 10.3324/haematol.2013.091249
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Concurrent loss of Ezh2 and Tet2 cooperates in the pathogenesis of myelodysplastic disorders (2013)
  • Author(s): Muto T, Sashida G, Oshima M, Wendt GR, Mochizuki-Kashio M, Nagata Y, Sanada M, Miyagi S, Saraya A, Kamio A, Nagae G, Nakaseko C, Yokote K, Shimoda K, Koseki H, Suzuki Y, Sugano S, Aburatani H, Ogawa S, Iwama A.
  • Journal Title: The Journal of experimental medicine Volume: 210 Pages: 2627-39
  • DOI: 10.1084/jem.20131144
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] BCOR and BCORL1 mutations in myelodysplastic syndromes and related disorders (2013)
  • Author(s): Damm F, et al, Sanada M, et al, *Kosmidar O. (8/31)
  • Journal Title: Blood Volume: 122 Pages: 3169-77
  • DOI: 10.1182/blood-2012-11-469619
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Recurrent mutations in multiple components of the cohesin complex in myeloid neoplasms. (2013)
  • Author(s): Kon A, et al, Sanada M, et al, *Ogawa S. (4/41)
  • Journal Title: Nat Genet. Volume: 122 Pages: 1232-7
  • DOI: 10.1038/ng.2731
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] The landscape of somatic mutations in Down syndrome-related myeloid disorders (2013)
  • Author(s): Yoshida K, et al, Sanada M, et al, *Ogawa S. (7/33)
  • Journal Title: Nat Genet Volume: 45 Pages: 1293-9
  • DOI: 10.1038/ng.2759
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Somatic SETBP1 mutations in myeloid malignancies (2013)
  • Author(s): Makishima H, et al, Sanada M, et al. *Maciejewski JP. (5/29)
  • Journal Title: Nat Genet Volume: 45 Pages: 942-6
  • DOI: 10.1038/ng.2696
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] An empirical Bayesian framework for somatic mutation detection from cancer genome sequencing data (2013)
  • Author(s): Shiraishi, Y. Sato, Y. Chiba, K. Okuno, Y. Nagata, Y. Yoshida, K. Shiba, N. Hayashi, Y. Kume, H. Homma, Y. Sanada, M. Ogawa, S. Miyano, S.
  • Journal Title: Nucleic Acids Res Volume: 41 Pages: e89
  • DOI: 10.1093/nar/gkt126
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Exome sequencing identifies secondary mutations of SETBP1 and JAK3 in juvenile myelomonocytic leukemia (2013)
  • Author(s): Sakaguchi, H. Okuno, Y. Muramatsu, H. Yoshida, K. Shiraishi, Y. Takahashi, M. Kon, A. Sanada, M. Chiba, K. Tanaka, H. Makishima, H. Wang, X. Xu, Y. Doisaki, S. Hama, A. Nakanishi, K. Takahashi, Y. Yoshida, N. Maciejewski, J. P. Miyano, S. Ogawa, S. Kojima, S.
  • Journal Title: Nat Genet Volume: 45 Pages: 937-41
  • DOI: 10.1038/ng.2698
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Deep sequencing in cancer research. (2013)
  • Author(s): Yoshida K, Sanada M, Ogawa S.
  • Journal Title: Jpnj clin oncol. Volume: 432 Pages: 110-5
  • DOI: 10.1093/jjco/hys206
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] ACTN1 Mutations Cause Congenital Macrothrombocytopenia (2013)
  • Author(s): Kunishima, S. Okuno, Y. Yoshida, K. Shiraishi, Y. Sanada, M. Muramatsu, H. Chiba, K. Tanaka, H. Miyazaki, K. Sakai, M. Ohtake, M. Kobayashi, R. Iguchi, A. Niimi, G. Otsu, M. Takahashi, Y. Miyano, S. Saito, H. Kojima, S. Ogawa, S.
  • Journal Title: Am J Hum Genet Volume: 92 Pages: 431-8
  • DOI: 10.1016/j.ajhg.2013.01.015
  • Peer Reviewed
• [Presentation] AMLにおけるゲノム異常
  • Author(s): 眞田 昌
  • Organizer: 第７５回日本血液学会学術集会
  • Place of Presentation: 札幌
  • Invited
• [Presentation] Role Of Sf3b1 On Hematopoiesis
  • Author(s): Manabu Matsunawa, Ryo Yamamoto, Masashi Sanada, Aiko Sato, Yusuke Shiozawa, Kenichi Yoshida, Yasunobu Nagata, Ayana Kon, Tetsuichi Yoshizato, Makoto Otsu, Kyoichi Isono, Haruhiko Koseki, Hiromitsu Nakauchi, and Seishi Ogawa
  • Organizer: 55th Annual Meeting of American Society of Hematology
  • Place of Presentation: New Orleans
• [Presentation] FUNCTIONAL ANALYSIS OF COHESIN MUTATIONS IN MYELOID NEOPLASMS
  • Author(s): Ayana Kon, Masashi Sanada, et al. (2/20)
  • Organizer: 18th Congress of the European Hematology Association
  • Place of Presentation: Stockholm
• [Presentation] Role Of Sf3b1 On Hematopoiesis
  • Author(s): Manabu Matsunawa, Ryo Yamamoto, Masashi Sanada, Aiko Sato, Yusuke Shiozawa, Kenichi Yoshida, Yasunobu Nagata, Ayana Kon, Tetsuichi Yoshizato, Makoto Otsu, Kyoichi Isono, Haruhiko Koseki, Hiromitsu Nakauchi, and Seishi Ogawa
  • Organizer: 第75回日本血液学会学術集会
  • Place of Presentation: 札幌