部位選択的ＤＮＡ脱メチル化誘導による新規細胞機能改変法の検討

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 24510284
• Research Institution: National Institute of Health Sciences
• Principal Investigator: 窪崎 敦隆 国立医薬品食品衛生研究所, 衛生微生物部, 主任研究官 (30425673)
• Project Period (FY): 2012-04-01 – 2015-03-31
• Keywords: DNA脱メチル化 / エピゲノム制御 / ゲノム / 発現制御

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、細胞機能を改変する新規の方法を開発する為に、部位選択的DNA脱メチル化の誘導後の状態を評価出来る分析法を準備した。具体的には、回収した精製DNAに含まれるシトシン、メチル修飾シトシン、ヒドロキシメチル化シトシンの比率を明らかにする為に、試料DNAを酵素処理によりnucleosideまで分解し、LC/MS/MS システムで試料中に含まれる修飾塩基量を分析する方法である。まず、酵素分解後産物の標準品として、2'-Deoxy-5-hydroxymethyl cytidine、2'-Deoxy-5-methylcytidine、2'-Deoxycytidine（東京化成）を入手し、API3200 Qtrap LC/MS/MS システム（AB SCIEX社）を分析に用いることで期待した十分な検出感度が得られることを確認した。次に、メチル修飾シトシンだけではなくヒドロキシメチル化シトシンを含んでいることが知られているヒト胚性癌細胞株NCCIT細胞を解析モデル細胞として、解析試料の準備条件を検討した。400万～500万個のNCCIT細胞よりNucleoSpin Tissue（タカラバイオ）を用いてゲノムDNAを回収し、RNase 処理後、DNA Clean & Concentrator kit（Zymo research社）で再度精製した。準備出来た純度の高いゲノムDNAをDNA Degradase Plus（Zymo research社）で処理し、nucleosideまで分解した。酵素処理が十分であったことは、アガロースゲル電気泳動で確認出来た。酵素処理後の試料をLC/MS/MS システムで解析した結果、細胞から回収したDNAに含まれる修飾シトシンを高感度に観察出来ることが明らかになった。