2013 Fiscal Year Research-status Report
１４－３－３タンパク質のリン酸化依存性結合阻害物質の探索
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24510320
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
渡邉 信元 独立行政法人理化学研究所, バイオプローブ応用研究ユニット, ユニットリーダー (90221689)
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| Keywords | タンパク質間相互作用 / 小分子化合物 / 14-3-3タンパク質 / 細胞周期 |
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| Research Abstract |
２４年度に構築した探索系を用いて結合を阻害する物質の探索を開始した。阻害剤の候補化合物群は研究室にすでに保有している化合物ライブラリーから本年度は約1万の精製化合物を利用した。蛍光タンパク質を用いたアッセイ系で約４０の化合物が１４－３－３σタンパク質と標的リン酸化ペプチドの結合を５０％以上阻害した。
そこで、これらの化合物について、ＨＥＫ２９３細胞で発現したヒトＷＥＥ１タンパク質と１４－３－３σタンパク質との結合を阻害する活性によって二次評価を行った。ヒトＷＥＥ１タンパク質はＧＳＴタンパク質との融合タンパク質としてＨＥＫ２９３細胞で発現し、その細胞抽出液を、１４－３－３σタンパク質を発現させた大腸菌の抽出液と混ぜた後にグルタチオンビーズによってプルダウンし、結合した１４－３－３σタンパク質をＳＤＳ電気泳動、ＣＢＢ染色によって定量した。この二次評価系で７つの化合物が終濃度１０μMで結合を５０％以上阻害した。
次にこれらの化合物について他の６種類のヒト１４－３－３タンパク質について結合を阻害するか否かの評価を行った。他の６種類のヒト１４－３－３タンパク質をコードするｃＤＮＡを単離し、大腸菌発現ベクターに導入し、タンパク質の発現を行い上述の１４－３－３σと同様の結合評価系を構築した。７つの化合物については、どれも他の１４－３－３も同様に阻害することが確認された。しかし、目標とする1μＭより低い５０％阻害濃度の化合物は現在までのところ得られていない。
しかし、探索系は期待通りに機能していることが確認できたので２６年度も探索を行いより強い活性を有する物質取得を目指すこととした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
上述のように、構築した阻害物質探索系を用いて化合物探索を行い期待される化合物が得られてきているので計画は順調に進行していると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
探索系が構築できて期待される活性を有する化合物が得られてきているので、さらに強い活性を有する化合物取得を目指して探索を行う。得られてくる物質を用いて１４－３－３タンパク質の細胞周期進行制御に関する役割を解析する研究計画を推進する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
予定していた海外の学会参加が他の業務と重なって参加を諦めたこと、強い活性を有する化合物が得られた場合に計画していた細胞培養系での実験を行うことができなかったことなどにより使用予定していたよりも少ない使用となった。
本年度にさらに化合物探索を多く推進することとするため、ハイスループット探索用のプラスチックプレート、ピペットチップなどの消耗品を当初の計画よりも多く使うこととする。このために昨年度の余剰額を使用する。
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Research Products
(8 results)
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[Journal Article] PI 3-kinase-dependent phosphorylation of Plk1-Ser99 promotes its association with 14-3-3γ and is required for metaphase-anaphase transition.2013
Author(s)
Kasahara, K., Goto, H., Izawa, I., Kiyono, T., Watanabe, N., Elowe, S., Nigg, EA., and Inagaki, M.
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Journal Title
Nat. Commun.
Volume: 4
Pages: 1882
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Identification of small molecule inhibitors of p27Kip1 ubiquitination by high-throughput screening.2013
Author(s)
Ooi, L-C., Watanabe, N., Futamura, Y., Sulaiman, SF., Darah, I., and Osada, H.
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Journal Title
Cancer Sci.
Volume: 104
Pages: 1461-1467
DOI
Peer Reviewed
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