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2013 Fiscal Year Research-status Report

14-3-3タンパク質のリン酸化依存性結合阻害物質の探索

Research Project

Project/Area Number 24510320
Research InstitutionInstitute of Physical and Chemical Research

Principal Investigator

渡邉 信元  独立行政法人理化学研究所, バイオプローブ応用研究ユニット, ユニットリーダー (90221689)

Keywordsタンパク質間相互作用 / 小分子化合物 / 14-3-3タンパク質 / 細胞周期
Research Abstract

24年度に構築した探索系を用いて結合を阻害する物質の探索を開始した。阻害剤の候補化合物群は研究室にすでに保有している化合物ライブラリーから本年度は約1万の精製化合物を利用した。蛍光タンパク質を用いたアッセイ系で約40の化合物が14-3-3σタンパク質と標的リン酸化ペプチドの結合を50%以上阻害した。
そこで、これらの化合物について、HEK293細胞で発現したヒトWEE1タンパク質と14-3-3σタンパク質との結合を阻害する活性によって二次評価を行った。ヒトWEE1タンパク質はGSTタンパク質との融合タンパク質としてHEK293細胞で発現し、その細胞抽出液を、14-3-3σタンパク質を発現させた大腸菌の抽出液と混ぜた後にグルタチオンビーズによってプルダウンし、結合した14-3-3σタンパク質をSDS電気泳動、CBB染色によって定量した。この二次評価系で7つの化合物が終濃度10μMで結合を50%以上阻害した。
次にこれらの化合物について他の6種類のヒト14-3-3タンパク質について結合を阻害するか否かの評価を行った。他の6種類のヒト14-3-3タンパク質をコードするcDNAを単離し、大腸菌発現ベクターに導入し、タンパク質の発現を行い上述の14-3-3σと同様の結合評価系を構築した。7つの化合物については、どれも他の14-3-3も同様に阻害することが確認された。しかし、目標とする1μMより低い50%阻害濃度の化合物は現在までのところ得られていない。
しかし、探索系は期待通りに機能していることが確認できたので26年度も探索を行いより強い活性を有する物質取得を目指すこととした。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

上述のように、構築した阻害物質探索系を用いて化合物探索を行い期待される化合物が得られてきているので計画は順調に進行していると考えている。

Strategy for Future Research Activity

探索系が構築できて期待される活性を有する化合物が得られてきているので、さらに強い活性を有する化合物取得を目指して探索を行う。得られてくる物質を用いて14-3-3タンパク質の細胞周期進行制御に関する役割を解析する研究計画を推進する。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

予定していた海外の学会参加が他の業務と重なって参加を諦めたこと、強い活性を有する化合物が得られた場合に計画していた細胞培養系での実験を行うことができなかったことなどにより使用予定していたよりも少ない使用となった。
本年度にさらに化合物探索を多く推進することとするため、ハイスループット探索用のプラスチックプレート、ピペットチップなどの消耗品を当初の計画よりも多く使うこととする。このために昨年度の余剰額を使用する。

  • Research Products

    (8 results)

All 2013 Other

All Journal Article (5 results) (of which Peer Reviewed: 2 results) Presentation (3 results) (of which Invited: 2 results)

  • [Journal Article] PI 3-kinase-dependent phosphorylation of Plk1-Ser99 promotes its association with 14-3-3γ and is required for metaphase-anaphase transition.2013

    • Author(s)
      Kasahara, K., Goto, H., Izawa, I., Kiyono, T., Watanabe, N., Elowe, S., Nigg, EA., and Inagaki, M.
    • Journal Title

      Nat. Commun.

      Volume: 4 Pages: 1882

    • DOI

      10.1111/cas.12246

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Identification of small molecule inhibitors of p27Kip1 ubiquitination by high-throughput screening.2013

    • Author(s)
      Ooi, L-C., Watanabe, N., Futamura, Y., Sulaiman, SF., Darah, I., and Osada, H.
    • Journal Title

      Cancer Sci.

      Volume: 104 Pages: 1461-1467

    • DOI

      10.1111/cas.12246

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] 細胞周期を制御するリン酸化依存タンパク質間相互作用阻害剤の開発2013

    • Author(s)
      渡辺信元
    • Journal Title

      実験医学

      Volume: 31 Pages: 297-302

  • [Journal Article] 新たな抗がん剤探索を加速する新スクリーニング技術2013

    • Author(s)
      長田裕之, 二村友史, 渡辺信元, 近藤恭光
    • Journal Title

      細胞工学

      Volume: 32 Pages: 655-659

  • [Journal Article] リン酸化依存性タンパク質間相互作用阻害物質の探索と抗がん剤への展開2013

    • Author(s)
      渡辺信元,長田裕之
    • Journal Title

      がん基盤生物学-革新的シーズ育成に向けて-

      Volume: 1 Pages: 305-310

  • [Presentation] Screening of inhibitors of p27Kip1 ubiquitination by SCFSkp2 (SCFSkp2による p27Kip1のユビキチン化阻害物質の探索)

    • Author(s)
      渡辺 信元, 新家 一男, 長田 裕之
    • Organizer
      第72回 日本癌学会学術総会
    • Place of Presentation
      パシフィコ横浜
  • [Presentation] 細胞周期阻害物質のハイスループット探索と創薬への応用

    • Author(s)
      渡辺信元
    • Organizer
      第17回日本がん分子標的治療学会学術集会シンポジウム
    • Place of Presentation
      国立京都国際会館
    • Invited
  • [Presentation] 生物機能解析のためのケミカルバイオロジー基盤技術

    • Author(s)
      渡邉信元
    • Organizer
      第3回CSJ化学フェスタ
    • Place of Presentation
      タワーホール船堀
    • Invited

URL: 

Published: 2015-05-28  

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