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2013 Fiscal Year Research-status Report

好熱菌酵素を低温高活性化するためのガイドラインの構築

Research Project

Project/Area Number 24560966
Research InstitutionTokyo University of Pharmacy and Life Science

Principal Investigator

赤沼 哲史  東京薬科大学, 生命科学部, 助教 (10321720)

Keywords酵素工学 / 好熱菌酵素 / 酵素利用
Research Abstract

超好熱菌由来脱水素酵素の、補酵素アデニン環に近接する非極性アミノ酸の置換による低温高活性化の検証と、高度好熱菌由来脱水素酵素の低温活性を常温菌由来相同酵素と同程度まで向上させる方法論の検討をおこなった。その成果の概要は以下のようになる。
1. 補酵素NADのアデニン環と相互作用する非極性アミノ酸の側鎖の体積をメチル基一つ分変化させることによる、好熱菌由来脱水素酵素の低温高活性化の一般性の検証をおこなった。超好熱菌Sulfolobus tokodaii由来NAD依存型グルコース脱水素酵素のアデニン結合残基であるVal254をIleに置換した変異体を構築し、解析したところ、25℃における酵素活性が野生型酵素より向上していることがわかった。また、耐熱性は損なわれなかった。この成果については、論文発表をおこなった。また、この成果は、本研究計画の主要な目的の一つであった、補酵素のアデニンと結合する非極性アミノ酸の側鎖体積をメチル基一つ分変化させることによる、好熱菌由来脱水素酵素の低温高活性化の一般性を示したと言える。
2. 本研究計画のもう一つの主要な目的である、好熱菌酵素の低温活性を常温菌相同酵素と同程度まで向上させるため、単独で低温高活性化に寄与するアミノ酸置換を複数個同時に導入した変異体を作製し、解析したが、検討したすべての組み合わせでさらなる低温高活性化は見られなかった。そこで、好熱菌酵素と常温菌酵素のアミノ酸配列の比較による高活性化戦略を探索し、その結果、T. thermophilus由来耐熱性3-イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素の25℃における酵素活性を10倍以上向上させるアミノ酸置換の組み合わせを同定した。この成果は、ここで採用した戦略の有効性を十分に示すものであり、この方法論については特許出願した。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

平成25年度の当初の予定は以下の通りであった。
1.グルコース脱水素酵素の補酵素のアデニンと結合する非極性アミノ酸を別の非極性アミノ酸に置換した変異型酵素を作製し、野生型酵素と比較して低温高活性化するか調べる。
2.T. thermophilus由来3-イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素の低温高活性化に寄与する複数のアミノ酸置換の効果の加算を検証する。
1については、超好熱菌Sulfolobus tokodaii由来NAD依存型グルコース脱水素酵素のアデニン結合残基であるVal254をIleに置換した変異体の25℃における酵素活性が、野生型酵素と比べ向上することを明らかにした。また、その際、耐熱性を損なうことがないことも明らかにした。この成果から、本研究計画の主要な目的の一つであった、補酵素のアデニンと結合する非極性アミノ酸の側鎖体積をメチル基一つ分変化させることによる、好熱菌由来脱水素酵素の低温高活性化の一般性の検証を達成できた。2については、単独で高活性化に寄与するアミノ酸置換を組み合わせた二重アミノ酸置換変異型酵素を構築し、解析したが、作製したすべての二重アミノ酸置換変異型酵素が、単独のアミノ酸置換を持つ変異型酵素と比べ酵素活性が低下した。そこで、好熱菌酵素の低温活性を常温菌酵素と同程度にまで高活性化させるための新たな戦略を確立し、実際にT. thermophilus由来3-イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素の25℃における酵素活性を10倍以上向上させるアミノ酸置換を同定した。この結果から、次年度内に好熱菌酵素の低温活性を常温菌酵素と同程度にまで向上させるための指針が得られた。
以上のように、平成25年度は概ね当初の予定通りに研究が進捗した。

Strategy for Future Research Activity

平成25年度中に、本研究計画の主要な目的の一つであった、補酵素のアデニンと結合する非極性アミノ酸の側鎖体積をメチル基一つ分変化させることによる、好熱菌由来脱水素酵素の低温高活性化の一般性の検証を達成することができた。そこで、次年度は本研究計画のもう一つの主要な目的である、好熱菌酵素の低温活性を常温菌相同酵素と同程度まで向上させるための研究をおこなう。
平成25年度中に、以下のルールに基づくT. thermophilus由来3-イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素を低温高活性化するための方法論を開発・検討した。(1)常温菌由来酵素とのアミノ酸配列の比較をおこなう、(2) 両者でアミノ酸が異なる部位に、常温菌型のアミノ酸置換を導入する、(3)ただし、活性中心から0.8 nm以内にあるアミノ酸部位のみを対象とする、(4)アミノ酸配列および立体構造上で近接する部位のアミノ酸置換は同時に導入する。そこで、次年度はこのルールに従って、多くのT. thermophilus由来3-イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素の低温高活性化に寄与するアミノ酸置換の同定を試みる。さらにアミノ酸置換の探索範囲を活性中心から0.8 nmよりも広げることも想定している。また、高活性化に寄与するアミノ酸置換を蓄積させることによって、最終的には常温菌酵素と同程度にまで低温活性が向上した変異体の獲得を試みる。また、その際に耐熱性がどのように変化するかを明らかにすることによって、耐熱性と低温酵素活性の間のトレードオフについても検討する。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

研究計画が当初の予想よりも順調に進行したため、学会発表の機会が増え、旅費は当初の計画よりも増加したが、それ以上に物品費等の出費を抑えることができた。そこで、その分を次年度に当初の予定を超えて研究を発展させるための物品費、旅費等に使用することにした。
物品費は、変異型酵素の遺伝子を作製するために必要となる部位特異的変異導入、塩基配列の確認、発現ベクターの作製、遺伝子発現のための遺伝子操作用試薬を購入するための費用、酵素の精製と解析のためのタンパク質発現精製用試薬と精製用カラムを購入するための費用、さらに、実験全般を通して用いることになるプラスチック・ガラス器具の購入費用として使用する予定である。
得られた研究成果を滞りなく発信するため、国内の学会に参加するための国内旅費が必要である。また、学術論文として国際誌にも発表するための費用(外国語論文の英文校閲に必要な費用と、投稿料、別刷り代)も必要となる。
本研究計画の遂行にあたり、研究代表者が所属する研究室の大学院生の研究補助を受けるので、その謝金を支払う予定である。

  • Research Products

    (26 results)

All 2014 2013 Other

All Journal Article (11 results) (of which Peer Reviewed: 10 results) Presentation (9 results) (of which Invited: 2 results) Book (2 results) Remarks (2 results) Patent(Industrial Property Rights) (2 results)

  • [Journal Article] Evaluation of the protein interfaces that form an intermolecular four-helix bundle as studied by computer simulation2014

    • Author(s)
      Fukuda, M., Komatsu, Y., Yamada, H., Morikawa, R., Miyakawa, T., Takasu, M., Akanuma, S., Yamagishi, A.
    • Journal Title

      Molecular Simulation

      Volume: 40 Pages: 498-503

    • DOI

      10.1080/08927022.2013.824571

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Preparation of Phi29 DNA polymerase free of amplifiable DNA using ethidium monoazide, an ultraviolet-free light-emitting diode lamp and trehalose2014

    • Author(s)
      Takahashi, H., Yamazaki, H., Akanuma, S., Kanahara, H., Saito, T., Chimuro, T., Kobayashi, T., Ohtani, T., Yamamoto, K., Sugiyama, S., Kobori, T.
    • Journal Title

      PLoS ONE

      Volume: 9 Pages: e82624

    • DOI

      10.1371/journal.pone.0082624

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] N-terminal hydrophobic amino acids of ATF5 confer IL-1β-induced stabilization.2014

    • Author(s)
      Abe, T., Kojima, M., Akanuma, S., Iwashita, H., Yamazaki, T., Okuyama, R., Ichikawa, K., Umemura, M., Nakano, H., Takahashi, S., Takahashi, Y.
    • Journal Title

      J. Biol. Chem.

      Volume: 289 Pages: 3888-3900

    • DOI

      10.1074/jbc.M113.491217

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Addition of negatively charged residues can reverse the decrease in the solubility of an acidic protein caused by an artificially introduced non-polar surface patch2014

    • Author(s)
      Yagi. S., Akanuma, S., Yamagishi, A.
    • Journal Title

      Biochim. Biophys. Acta

      Volume: 1844 Pages: 553-560

    • DOI

      10.1016/j.bbapap.2013.12.011

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Characterization of the low-temperature activity of Sulfolobus tokodaii glucose-1-dehydrogenase mutants2014

    • Author(s)
      Sugii, T., Akanuma, S., Yagi, S., Yagyu, K., Shimoda, Y., Yamagishi, A.
    • Journal Title

      J. Biosci. Bioeng.

      Volume: in press Pages: in press

    • DOI

      10.1016/j.jbiosc.2014.03.002

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Coarse-Grained Molecular Dynamics Simulation of IPMDH2014

    • Author(s)
      Hirata Y, Komatsu Y, Fukuda M, Yamada H, Miyakawa T, Morikawa R, Akanuma S, Yamagishi A, Takasu M.
    • Journal Title

      JPS Conf. Proc.

      Volume: 1 Pages: 016010

    • DOI

      doi:10.1016/j.jbiosc.2014.03.002

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Computer Simulation Analysis of the Protein Binding Interfaces that Form a 4-Helix Bundle Motif2014

    • Author(s)
      Fukuda M, Yamada H, Morikawa R, Miyakawa T, Takasu M, Akanuma S, Yamagishi A.
    • Journal Title

      JPS Conf. Proc.

      Volume: 1 Pages: 016020

    • DOI

      doi:10.1016/j.jbiosc.2014.03.002

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] 全生物の共通祖先遺伝子の復元2014

    • Author(s)
      赤沼哲史、山岸明彦
    • Journal Title

      バイオサイエンスとインダストリー

      Volume: 72 Pages: 19-23

  • [Journal Article] The simulation study of protein-protein interfaces based on the 4-helix bundle structure2013

    • Author(s)
      Fukuda, M., Komatsu, Y., Morikawa, R., Miyakawa, T., Takasu, M., Akanuma, S., Yamagishi A.
    • Journal Title

      AIP Conf. Proc.

      Volume: 1518 Pages: 606-609

    • DOI

      10.1063/1.4794642

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Experimental evidence for the thermophilicity of ancestral life.2013

    • Author(s)
      Akanuma, S., Nakajima, Y., Yokobori, S., Kimura, M., Nemoto, N., Mase, T., Miyazono, K., Tanokura, M., Yamagishi, A.
    • Journal Title

      Proc. Natl. Acad. Sci. USA

      Volume: 110 Pages: 11067-11072

    • DOI

      10.1073/pnas.1308215110

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] 祖先型設計法を用いた耐熱性タンパク質の配列探索2013

    • Author(s)
      赤沼哲史
    • Journal Title

      生物物理

      Volume: 307 Pages: 128-133

    • DOI

      10.2142/biophys.53.128

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] 進化情報に基づく古代タンパク質の復元とタンパク質設計への応用2014

    • Author(s)
      赤沼哲史
    • Organizer
      第23回 内毒素・LPS研究会
    • Place of Presentation
      東京
    • Year and Date
      20140628-20140628
    • Invited
  • [Presentation] 酵素の温度適応化:好熱菌酵素の低温高活性化と祖先配列推定による安定化酵素の設計2013

    • Author(s)
      赤沼哲史,林清香,大貫若菜,徳永千尋,杉井太亮,木村彦乃,坂本さやか,八木創太,横堀伸一,山岸明彦
    • Organizer
      第36回日本分子生物学会年会
    • Place of Presentation
      神戸
    • Year and Date
      20131203-20131206
  • [Presentation] Experimentally testing the hypothesis of a limited amino acid repertoire in primitive proteins2013

    • Author(s)
      Akanuma, S., Nakajima, Y., Yokobori, S., Yamagishi, A.
    • Organizer
      International Astrobiology Workshop 2013
    • Place of Presentation
      相模原
    • Year and Date
      20131128-20131130
    • Invited
  • [Presentation] Empirical estimation of the environmental temperature of the last universal common ancestor2013

    • Author(s)
      Akanuma, S., Nakajima, Y., Yokobori, S., Yamagishi, A.
    • Organizer
      第51回日本生物物理学会年会
    • Place of Presentation
      京都
    • Year and Date
      20131028-20131030
  • [Presentation] Enhancing the low-temperature activities of thermophilic dehydrogenases2013

    • Author(s)
      Akanuma, S., Yamagishi, A.
    • Organizer
      Thermophiles 2013
    • Place of Presentation
      Regensburg
    • Year and Date
      20130908-20130913
  • [Presentation] 全生物共通祖先生物の生育温度の実験による推定2013

    • Author(s)
      赤沼哲史、中島慶樹、横堀伸一、山岸明彦
    • Organizer
      日本進化学会第15回大会
    • Place of Presentation
      つくば
    • Year and Date
      20130828-20130831
  • [Presentation] 遺伝暗号の起源2013

    • Author(s)
      赤沼哲史
    • Organizer
      総研大「惑星科学と生命科学の融合」第3回研究会
    • Place of Presentation
      北杜
    • Year and Date
      20130808-20130810
  • [Presentation] 全生物共通祖先コモノートの生育温度を実験により推定2013

    • Author(s)
      赤沼哲史、中島慶樹、横堀伸一、山岸明彦
    • Organizer
      第26回日本Archaea研究会講演会
    • Place of Presentation
      東京
    • Year and Date
      20130719-20130720
  • [Presentation] Restricted amino acid usage in proteins as studied by protein simplification engineering of a resurrected ancestral protein2013

    • Author(s)
      Akanuma, S., Shimada, M., Nakajima, Y., Yokobori, S., Yamagishi, A.
    • Organizer
      第27回地球惑星科学連合大会
    • Place of Presentation
      千葉
    • Year and Date
      20130519-20130524
  • [Book] 「進化分子工学を利用したタンパク質分子育種技術」、進化分子工学 -高速分子進化によるタンパク質・核酸の開発-2013

    • Author(s)
      赤沼哲史、山岸明彦
    • Total Pages
      466
    • Publisher
      エヌ・ティー・エス
  • [Book] 「高機能タンパク質創製技術の現状と展望」、技術予測レポート2023 上巻2013

    • Author(s)
      玉腰雅忠、八木創太、赤沼哲史、山岸明彦
    • Total Pages
      324
    • Publisher
      日本能率協会総合研究所
  • [Remarks] 極限環境生物学研究室

    • URL

      http://logos.ls.toyaku.ac.jp/~lcb-7/

  • [Remarks] 全生物共通祖先生物の生育温度の実験による推定に成功~生命の起源の解明に期待~

    • URL

      http://www.toyaku.ac.jp/news/detail/id/2022/publish/1/

  • [Patent(Industrial Property Rights)] 低温における酵素活性を向上させた好熱菌由来酵素の改変体の取得方法、及び低温における酵素活性が向上しているサーマス・サーモフィラス由来3-イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素の改変体2014

    • Inventor(s)
      赤沼哲史、木村彦乃、山岸明彦、八尾理文
    • Industrial Property Rights Holder
      赤沼哲史、木村彦乃、山岸明彦、八尾理文
    • Industrial Property Rights Type
      特許
    • Industrial Property Number
      特願2014-040270
    • Filing Date
      2014-03-03
  • [Patent(Industrial Property Rights)] 白金結合剤、及びその利用2013

    • Inventor(s)
      山岸明彦、赤沼哲史、新納寛也、内田達也、秋山勇人、八尾理文
    • Industrial Property Rights Holder
      山岸明彦、赤沼哲史、新納寛也、内田達也、秋山勇人、八尾理文
    • Industrial Property Rights Type
      特許
    • Industrial Property Number
      特願2013-83104
    • Filing Date
      2013-04-11

URL: 

Published: 2015-05-28  

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