• Search Research Projects
  • Search Researchers
  • How to Use
  1. Back to project page

2012 Fiscal Year Research-status Report

植物ホルモンの新規な代謝酵素の同定と機能解析

Research Project

Project/Area Number 24580134
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research (C)

Research InstitutionHokkaido University

Principal Investigator

松井 博和  北海道大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (90109504)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 佐分利 亘  北海道大学, (連合)農学研究科(研究院), 助教 (00598089)
松浦 英幸  北海道大学, (連合)農学研究科(研究院), 准教授 (20344492)
Project Period (FY) 2012-04-01 – 2015-03-31
Keywordsジャスモン酸 / ツベロン酸 / モノオキシゲナーゼ / P450
Research Abstract

ジャスモン酸は病傷害ストレス応答や生長を制御する植物ホルモンである。ジャスモン酸による遺伝子発現促進については,詳細な分子機構が明らかにされつつあるが,不活性化機構はいまだ明らかではない。最近の知見によるとシグナル本体として働くジャスモン酸とイソロイシンの接合体(JA-Ile)あるいはジャスモン酸が水酸化されることにより不活性されると考えられている。JA-Ileと異なり,ツベロン酸の生成機構は全く明らかでない。本研究ではツベロン酸生成機構の解明を目的とした。ツベロン酸の生成経路として,JA-Ile水酸化物の加水分解とJAの直接的な水酸化を想定した。JA-Ile水酸化酵素のCYP94B3と共発現が確認されているILL6は,インドール酢酸-アスパラギン酸接合体の加水分解酵素と配列類似性を示す。ILL6がJA-Ile水酸化物の加水分解酵素であると推定し,大腸菌による組換えタンパク質生産系を構築した。グルタチオンS-トランスフェラーゼとの融合蛋白質は可溶性タンパク質として生産された。得られたタンパク質をJA-Ileおよびその水酸化物と反応させたが,いずれの加水分解も確認されなかった。次にJAの水酸化酵素として注目したCYP94D1とCYP94D2をそれぞれ酵母においてNADPH-シトクロームP450レダクターゼと共発現させ,培地にJAおよびJA-Ileを添加してこれらの培養液中での水酸化を検討したが,水酸化は確認されなかった。酵母の無細胞抽出液中の組換えタンパク質は付加したHisタグを利用したウェスタンブロッティングによりいずれも検出されなかったことから組換えタンパク質が生産されていないことが考えられた。このため,CYP94D1とCYP94D2の遺伝子破壊株におけるツベロン酸量の解析を行うこととした。現在これらの遺伝子破壊株のホモ接合体の単離を進めている。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

平成24年度は,ターゲットとしたモノオキシゲナーゼであるCYP94D1とCYP94D2,ツベロン酸-Ileの加水分解酵素と推定したILL6の組換えタンパク質の生化学的機能解析を予定していた。本年度は予定通り,これらの酵素生産系を構築し,それぞれの機能解析を実施した。結果としては,想定した結果が得られなかったが,CYP94D1とCYP94D2については酵素の生産がおこなわれなかったことが活性が得られなかった原因であると考えており,次年度以降予定しているの変異体や過剰発現体の解析により結論を導くことができると考えている。ILL6についてはタンパク質の生産がおこなわれているにもかかわらず,活性が見られなかったため,想定していたツベロン酸-Ileの加水分解酵素ではないと考えられる。このため,以降の解析はCYP94D1とCYP94D2の機能解析に注力すべきと判断し,ILL6の変異体の解析は実施しないこととした。平成24年度の計画ではCYP94D1とCYP94D2遺伝子の変異体の単離も予定していた。シロイヌナズナの変異体のバンクよりCYP94D1とCYP94D2の欠損株の種子を購入し,CYP94D1についてはホモ接合体の単離に成功している。CYP94D2については,現在ホモ接合体の単離作業を行っているところである。CYP94D2のホモ接合体の単離作業のみが計画より若干遅れているが,次年度以降に挽回が十分可能であると考えている。

Strategy for Future Research Activity

CYP94D1とCYP94D2の生理機能解析を中心として研究を進める。組換えタンパク質生産系の構築については,宿主との相性が悪く当初期待していた結果が得られなかったため,両ターゲット遺伝子の欠損株を用いてジャスモン酸類の内生量の変化を確認する。もし想定通りジャスモン酸の水酸化に関わっていた場合,ジャスモン酸シグナルの不活性化が不全となると予想されるため,ジャスモン酸に過敏になるものと推察される。このため,ジャスモン酸感受性の指標となる根の伸長阻害実験により変異体の評価を行う。変異体においてジャスモン酸に対する感受性の変化が見られた場合は,各変異体に欠損遺伝子を導入し,表現型が野生型に回復するかを検証する。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

該当なし

  • Research Products

    (21 results)

All 2013 2012

All Journal Article (5 results) (of which Peer Reviewed: 5 results) Presentation (16 results)

  • [Journal Article] Identification and characterization of cellobiose 2-epimerase from various aerobes2013

    • Author(s)
      Teruyo Ojima, Wataru Saburi, Takeshi Yamamoto, Haruhide Mori, Hirokazu Matsui
    • Journal Title

      Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry

      Volume: 77 Pages: 189-193

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Crystal structure of Ruminococcus albus cellobiose 2-epimerase: structural insights into epimerization of unmodified sugar2013

    • Author(s)
      Takaaki Fujiwara, Wataru Saburi, Sota Inoue, Haruhide Mori, Hirokazu Matsui, Isao Tanaka, Min Yao
    • Journal Title

      FEBS Letters

      Volume: 587 Pages: 840-846

    • DOI

      10.1016/j.febslet.2013.02.007.

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Metabolic mechanism of mannan in a ruminal bacterium, Ruminococcus albus, involving two mannoside phosphorylases and cellobiose 2-epimerase: discovery of a new carbohydrate phosphorylase, β-1,4-mannooligosaccharide phosphorylase2012

    • Author(s)
      Ryosuke Kawahara, Wataru Saburi, Rei Odaka, Hidenori Taguchi, Shigeaki Ito, Haruhide Mori, and Hirokazu Matsui
    • Journal Title

      Journal of Biological Chemistry

      Volume: 287 Pages: 42389-42399

    • DOI

      10.1074/jbc.M112.390336

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Purification and characterization of a liuefying α-amylase from alkalophilic termophilic Bacillus sp. AAH-312012

    • Author(s)
      Daehoon Kim, Naoki Morimoto, Wataru Saburi, Atsushi Mukai, Koji Imoto, Toshihiko Takehana, Seiji Koike, Haruhide Mori, Hirokazu Matsui
    • Journal Title

      Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry

      Volume: 76 Pages: 1378-1383

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Immobilization of a thermostable cellobiose 2-epimerase from Rhodothermus marinus JCM9785 and continuous production of epilactose2012

    • Author(s)
      Hiroki Sato, Wataru Saburi, Teruyo Ojima, Hidenori Taguchi, Haruhide Mori, Hirokazu Matsui
    • Journal Title

      Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry

      Volume: 76 Pages: 1584-1587

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] Halomonas sp. H11株由来α-グルコシダーゼ組換え酵素の大腸菌による生産と諸性質2013

    • Author(s)
      城戸 悠輔,佐分利 亘,小島 晃代,森 春英,松井 博和
    • Organizer
      日本農芸化学会2013年度大会
    • Place of Presentation
      東北大学,仙台
    • Year and Date
      20130324-20130328
  • [Presentation] イネ由来ツベロン酸β-グルコシドグルコシダーゼアイソザイム1の機能解析2013

    • Author(s)
      武田 遼介,姫野 奈美,佐分利 亘,和久田 真司,森 春英,松浦 英幸,鍋田 憲助,今井 亮三,松井 博和
    • Organizer
      日本農芸化学会2013年度大会
    • Place of Presentation
      東北大学,仙台
    • Year and Date
      20130324-20130328
  • [Presentation] イネ由来ツベロン酸β-グルコシドグルコシダーゼアイソザイムのアグリコン認識メカニズムの解析2013

    • Author(s)
      姫野 奈美,佐分利 亘,武田 遼介,和久田 真司,松浦 英幸,鍋田 憲助,森 春英,今井 亮三,松井 博和
    • Organizer
      日本農芸化学会2013年度大会
    • Place of Presentation
      東北大学,仙台
    • Year and Date
      20130324-20130328
  • [Presentation] シロイヌナズナにおけるCYP94B2の機能解析2013

    • Author(s)
      天野 就基,北岡 直樹,川出 洋,谷口 沙希,佐分利 亘,松井 博和,松浦 英幸
    • Organizer
      日本農芸化学会2013年度大会
    • Place of Presentation
      東北大学,仙台
    • Year and Date
      20130324-20130328
  • [Presentation] COLD SHOCK DOMAIN PROTEIN 3 regulates salt and drought stress tolerance in Arabidopsis2013

    • Author(s)
      Shunya Sato, Myung-Hee Kim, Kentaro Sasaki, Wataru Saburi, Hirokazu Matsui, Ryozo Imai
    • Organizer
      第54回日本植物生理学会年
    • Place of Presentation
      岡山大学,岡山
    • Year and Date
      20130321-20130323
  • [Presentation] イネの傷害時のSAGをdonorとしたTAに対する糖転移反応2012

    • Author(s)
      竹松 知紀,宮沢 吉郎,瀬戸 義哉,和久田 真司,佐分利 亘,鍋田 憲助,松井 博和,松浦 英幸
    • Organizer
      平成24年度日本農芸化学会北海道支部講演会
    • Place of Presentation
      北海道大学,札幌
    • Year and Date
      20121102-20121102
  • [Presentation] 組換えツベロン酸グルコシドグルコシダーゼの酵素化学的諸性質の解析2012

    • Author(s)
      武田 遼介,姫野 奈美,佐分利 亘,和久田 真司,森 春英,松浦 英幸,鍋田 憲助,今井 亮三,松井 博和
    • Organizer
      平成24年度日本農芸化学会北海道支部講演会
    • Place of Presentation
      北海道大学,札幌
    • Year and Date
      20121102-20121102
  • [Presentation] ツベロン酸グルコシド加水分解酵素の基質認識機構の解明2012

    • Author(s)
      姫野 奈美,和久田 真司,武田 遼介,佐分利 亘,森 春英,松浦 英幸,鍋田 憲助,今井 亮三,松井 博和
    • Organizer
      平成24年度日本農芸化学会北海道支部講演会
    • Place of Presentation
      北海道大学,札幌
    • Year and Date
      20121102-20121102
  • [Presentation] Bacillus sp. AAH-31株由来耐熱性アルカリα-アミラーゼの高機能化に関する研究2012

    • Author(s)
      玉村 尚也,向井 惇,森本 奈保喜,竹花 稔彦,佐分利 亘,森 春英,小池 誠治,松井 博和
    • Organizer
      平成24年度日本農芸化学会北海道支部講演会
    • Place of Presentation
      北海道大学,札幌
    • Year and Date
      20121102-20121102
  • [Presentation] セロビオース2-エピメラーゼを用いたエピラクトースの実用的酵素合成法の開発2012

    • Author(s)
      佐分利 亘,小島 晃代,佐藤 央基,田口 秀典,森 春英,松井 博和
    • Organizer
      応用糖質科学シンポジウム
    • Place of Presentation
      東京農工大学,東京
    • Year and Date
      20120921-20120921
  • [Presentation] cellobiose phosphorylaseのepilactose phosphorylaseへの改変2012

    • Author(s)
      羽村 健,佐分利 亘,森 春英,松井 博和
    • Organizer
      日本応用糖質科学会2012年度大会
    • Place of Presentation
      東京農工大学,東京
    • Year and Date
      20120919-20120921
  • [Presentation] シロイヌナズナADP-glucose pyrophosphorylase遺伝子の発現制御因子の解析2012

    • Author(s)
      石塚 佐都子,和久田 真司,佐分利 亘,今井 亮三,松井 博和
    • Organizer
      日本応用糖質科学会2012年度大会
    • Place of Presentation
      東京農工大学,東京
    • Year and Date
      20120919-20120921
  • [Presentation] Ruminococcus albus NE1株由来マンノシルグルコースホスホリラーゼ (RaMP1) の一般酸触媒残基の解析2012

    • Author(s)
      尾高 伶,佐分利 亘,川原 良介,森 春英,松井博和
    • Organizer
      日本応用糖質科学会2012年度大会
    • Place of Presentation
      東京農工大学,東京
    • Year and Date
      20120919-20120921
  • [Presentation] Ruminococcus albus由来セロデキストリンホスホリラーゼの諸性質とリン酸結合部位の解析2012

    • Author(s)
      澤野 達也,佐分利 亘,森 春英,松井博和
    • Organizer
      日本応用糖質科学会2012年度大会
    • Place of Presentation
      東京農工大学,東京
    • Year and Date
      20120919-20120921
  • [Presentation] Ruminococcus albus由来セロビオース2-エピメラーゼ (RaCE) のX線結晶構造解析2012

    • Author(s)
      藤原 孝彰,佐分利 亘,井上 聡太,森 春英,松井 博和,姚 閔,田中 勲
    • Organizer
      日本応用糖質科学会2012年度大会
    • Place of Presentation
      東京農工大学,東京
    • Year and Date
      20120919-20120921
  • [Presentation] Biochemical characterization of two mannosyl glucose phosphorylase isozymes from Ruminococcus albus2012

    • Author(s)
      Wataru Saburi, Ryosuke Kawahara, Hidenori Taguchi, Haruhide Mori, Hirokazu Matsui
    • Organizer
      26th International Carbohydrate Symposium
    • Place of Presentation
      Madrid City centre (Hotel Melia Castilla) Madrid, Spain
    • Year and Date
      20120722-20120727

URL: 

Published: 2014-07-24  

Information User Guide FAQ News Terms of Use Attribution of KAKENHI

Powered by NII kakenhi