2013 Fiscal Year Research-status Report
健康と長寿を指向したアミノ糖含有ヘテロ糖鎖による腸内環境改善技術の開発
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24580179
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| Research Institution | Kinki University |
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Principal Investigator |
芦田 久 近畿大学, 生物理工学部, 教授 (40379087)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
福澤 秀哉 京都大学, 生命科学研究科, 教授 (30183924)
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| Keywords | ヘテロオリゴ糖 / ビフィズス菌 / グリコシダーゼ / プレバイオティクス |
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| Research Abstract |
24年度には、畜産廃棄物であるブタ胃ムチンから組換えエンド-α-N-アセチルガラクトサミニダーゼを用いてビフィズス菌増殖活性のあるヘテロ２糖Galβ1-3GalNAc（ガラクト-N-ビオース）を遊離・調製する方法を確立した。25年度には、ブタ胃ムチンにBifidobacterium bifidum由来の組換えラクト-N-ビオシダーゼを作用させたところ、同様の生理活性をもつヘテロ２糖Galβ1-3GlcNAc（ラクト-N-ビオース）が遊離することを見出した。Galβ1-3GlcNAcβ1-R構造は１型糖鎖と呼ばれ、ヒトミルクオリゴ糖や糖脂質糖鎖に存在が知られているが、胃ムチンのO-グリカンにもかなりの量が含まれていることが明らかになった。
ラクト-N-ビオシダーゼについては、25年度に共同研究者らにより結晶構造解析が明らかにされ、J. Biol. Chem.に論文が掲載された。また、既知のラクト-N-ビオシダーゼ遺伝子をもたない B. longum subsp. longum から全く新奇のラクト-N-ビオシダーゼ遺伝子をクローニングし、共同研究者とともにJ. Biol. Chem.に論文を発表した。
胃ムチンの糖鎖末端には、胃ムチンに特異的はGlcNAcα1-4Galβ1-R構造が存在する。この糖鎖構造はピロリ菌の増殖を阻害し、天然の抗菌成分であることがわかっている。ウェルシュ菌由来の組換えエンド-β-ガラクトシダーゼ（Endo-β-Gal-GnGa）を作用させてピロリ菌阻害活性が期待できるヘテロ２糖GlcNAcα1-4Galの調製も試みた。
以上のとおり、ブタ胃ムチンから特異的な酵素を利用することで、Galβ1-3GalNAc、Galβ1-3GlcNAc、GlcNAcα1-4Galの３種の生理活性ヘテロ２糖を遊離・調製できることを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究分担者による、糖転移活性の向上したエンド-α-N-アセチルガラクトサミニダーゼの変異体酵素の作成については大きな進展が見られなかった。そこで本酵素を用いた方法の探索は中断し、26年度には研究分担者から外れていただくことにした。
一方、ラクト-N-ビオシダーゼを胃ムチンに作用させたところ、Galβ1-3GlcNAc（ラクト-N-ビオース）が遊離することを見出した。これは当初計画にない結果であるが、胃ムチンがラクト-N-ビオースの供給源となることを明らかにした点で重要な進捗である。
ラクト-N-ビオシダーゼについては25年度に結晶構造が明らかにされたため、変異導入により糖転移活性の上昇した変異体酵素の作成に取りかかっている。また、胃ムチン糖鎖に含まれる第３の生理活性ヘテロ２糖であるGlcNAcα1-4Galの調製方法を確立することができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
還元末端がフリーのラクト-N-ビオースは熱に対して不安定であるため、ラクト-N-テトラオース（Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc）、あるいはGalβ1-3GlcNAcβ1-3Galなどの３糖を合成できれば加工食品への添加も容易になる。そこで、結晶構造が明らかにされたラクト-N-ビオシダーゼの活性中心に点変異を導入して、胃ムチンから糖転移反応により４糖ないしは３糖の形で回収する方法を検討する。また、組換え酵素ではなく微生物菌体を用いて各種ヘテロ２糖を調製する方法を検討する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
端数を使い切れなかったため。
160円の繰越金が生じたが、次年度の物品費に充当する。
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[Journal Article] Crystal structures of a glycoside hydrolase family 20 lacto-N-biosidase from Bifidobacterium bifidum2013
Author(s)
Ito T, Katayama T, Hattie M, Sakurama H, Wada J, Suzuki R, Ashida H, Wakagi T, Yamamoto K, Stubbs KA, Fushinobu S
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Journal Title
J. Biol. Chem.
Volume: 288
Pages: 11795-11806
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Lacto-N-biosidase encoded by a novel gene of Bifidobacterium longum subsp. longum shows unique substrate specificity and requires a designated chaperon for its active expression2013
Author(s)
Sakurama H, Kiyohara M, Wada J, Honda Y, Yamaguchi M, Fukiya S, Yokota A, Ashida H, Kumagai H, Kitaoka M, Yamamoto K, Katayama T
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Journal Title
J. Biol. Chem.
Volume: 288
Pages: 25194-25296
DOI
Peer Reviewed
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