2013 Fiscal Year Research-status Report
シオミズツボワムシ腸管内における魚病細菌の病原性関連遺伝子群の解析
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24580270
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| Research Institution | Nagasaki University |
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Principal Investigator |
菅 向志郎 長崎大学, 水産・環境科学総合研究科, 准教授 (60569185)
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| Keywords | 魚病細菌 / 病原性因子 |
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| Research Abstract |
シオミズツボワムシの腸管内に取り込ませた魚病細菌と通常の人工培地で培養した魚病細菌のタンパク質発現パターンを網羅的に比較し、発現の異なるタンパク質と魚病細菌が生産する病原性物質との関連を明らかにすることで、魚類における細菌性疾病の発症機構の一端を明らかにするのが本研究の目的である。昨年度の研究で、魚病細菌のシオミズツボワムシに対する病原性の有無、効率よくシオミズツボワムシ腸管内に魚病細菌を取り込ませる菌濃度を明らかにした。今年度は、シオミズツボワムシに取り込ませる魚病細菌の菌株の違いによるタンパク質発現の相違を遺伝的に解析するため、パルスフィールドゲル電気泳動（PFGE）による全ゲノムDNA用いたジェノタイピングを行った。PFGEを行う為に、損傷のないゲノムDNA精製法、ジェノタイピングに最適な制限酵素の選択、制限酵素断片長多型解析に最適なアガロースゲル濃度、バッファー濃度と温度、パルスタイム、電圧、パルス角度、泳動時間などの条件を最適化した。その結果、由来の異なるEdwardsiella tardaのPFGE解析には、終濃度0.8％の低融点アガロースで菌体を包埋しリゾチームとプロテイナーゼKで消化することで損傷の少ないゲノムDNAが精製可能であった。このゲル包埋DNAを制限酵素Spe IもしくはXba Iで2日間消化し、0.5×TBE Buffer 2.2 L、電圧6 V/cm、泳動時間18時間、パルスタイム0.5～25秒、パルス角度120°、水温14℃の条件で泳動することでジェノタイピングに最適な制限酵素断片長多型解析が可能であることを見出した。PFGE解析の結果、E. tarda 14菌株は由来毎に4タイプに分類され、遺伝的に異なることを見出した。よって、シオミズツボワムシ内でのタンパク質発現を解析するためには、遺伝的に異なる4タイプでの比較が必要であることが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
外環境が異なる条件下での菌体のタンパク質発現を解析するためには、遺伝的な相違を明らかにする必要がある。従来の菌株の分類は、数個の遺伝子配列や血清型別でおこなわれており、これらの解析では全ゲノムレベルでの相違が不明であった。これまで魚病細菌ではほとんど解析されていないPFGEによる全ゲノム配列の相違を解析する手法を確立し、由来の異なる細菌株の遺伝的な相違を数値化することが出来た。以上のことから、全体として順調に研究が進んでいると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
H25年度に実施した研究をもとに、遺伝的な相違を確認した病原細菌（Edwardsiellaの他に、Vibrio、Streptococcus等）を無菌的に培養したシオミズツボワムシの腸管内に取り込ませ、この腸管内の細菌と人工培地で培養した細菌よりタンパク質を単離する。この単離したタンパク質を2次元電気泳動により分離し、発現の有無、もしくは発現量が異なるタンパク質をピックアップしたのち、質量分析機器で解析することで、タンパク質機能の特定を試みる。さらに、これらのタンパク質の遺伝子配列を解析し、遺伝子レベルでの発現量の変化を明らかにする。これらのタンパク質と既知の病原因子との関連を解析することで、環境変化と病原性の関連を明らかにする。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
タンパク質の2次元電気泳動を実施する予定であったが、全ゲノムを用いた遺伝子解析に時間を要し、2次元電気泳動に必要な試薬類を購入していないため繰越金として次年度使用額が生じた。
タンパク質の2次元電気泳動に必要な試薬類や魚病細菌の培養用試薬を購入する。また、実験の進捗状況に応じてタンパク質精製に必要な分画機の購入に使用する予定である。
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